Hvad er bisulfit -sekventering?

Bisulfit -sekventering er en metode, hvor forskellige regioner af DNA analyseres ved anvendelse af methylering. Methylering er processen med at tilsætte et specifikt molekyle, kaldet en methylgruppe, til et nukleotid, i dette tilfælde normalt et cytosin. Inaktive nukleotider methyleres ofte, så denne metode kan bruges til forskellige formål, fra bestemmelse af aktive regioner af et genom til at identificere genrige regioner. Ved bisulfit-sekventering påvirkes methylerede cytosiner ikke af sekventeringsprocessen, mens ikke-methylerede cytosiner omdannes til uracil, en nukleotid, der normalt ikke findes i det genetiske materiale, deoxyribonukleinsyre (DNA.)

Denne metode er meget følsomme over for ændringer i methylering, så små ændringer i binding kan give forskere specifikke oplysninger om særlige nukninger. Natriumbisulfit konverterer cytosin til uracil, men omdannelsen sker i et miljø, hvor methyleret cytosin ikke vil gennemgå denne ændring. Når bisulfit -sekventering er afsluttet, er oprindelsenAl DNA er blevet omdannet til et signifikant anderledes molekyle. Cytosiner vil være stærkt udtømt eller potentielt fraværende. Hvis der stadig findes et cytosin i dette konverterede molekyle, repræsenterer det et naturligt methyleret cytosin i det genom, der er under overvejelse.

Som alle eksperimentelle protokoller har bisulfit -sekventering ulemper. Dens mest markante ulempe er, at det kræver en meget høj saltkoncentration for at fungere korrekt. Saltet tilskynder til annealing af enkeltstrenget DNA til dets mere naturlige dobbelt helix, og natriumbisulfit kan ikke altid nå cytosiner, når de er en del af dobbeltstrenget DNA. Hvis saltkoncentrationen er for høj, kan et antal cytosiner muligvis ikke omdannes til uracil, hvilket resulterer i falsk identifikation af methylerede cytosiner i et genom. Denatureringsmidler kan være nødvendige for at minimere antallet af falske positive identifikationer.

Stor amoUNT'er af genomiske data er ikke nødvendige for bisulfit -sekventering, så metoden har en nyttig anvendelse, der analyserer kliniske prøver. Den originale nukleinsyrekilde betyder ikke noget, men kilden skal være DNA. I teorien kunne ribonukleinsyre (RNA) sekventeres ved anvendelse af denne metode, da de fleste RNA er enkelt strandet og ikke ville være så modtagelige for falske positive på grund af blokerede nukleotider. Når man udføres i praksis, er bisulfit -sekventering imidlertid ikke nyttigt til RNA, fordi RNA naturligt har uracil i det. Uden en slags ekstern markering eller tilføjelse til protokollen ville konverterede cytosiner ikke kunne skelnes fra naturlig uracil.

Når man påtager sig nogen form for sekventeringsmetodologi, er nøjagtighed og præcision afgørende. Følsomme metoder som bisulfit -sekventering tilbyder et pålideligt middel til sekvensanalyse, som igen muliggør genanalyse og identifikation af mål for medikamenter og terapier. Selvom denne metode ikke kan bruges til levende mennesker, kan den stadig væreaf stor hjælp med kun de mindste vævsprøver at arbejde med.