Hvad er Bisulfite Sequencing?

Bisulfit-sekventering er en metode, hvor forskellige regioner af DNA analyseres ved anvendelse af methylering. Methylering er processen med at tilføje et specifikt molekyle, kaldet en methylgruppe, til et nukleotid, i dette tilfælde normalt et cytosin. Inaktive nukleotider methyleres ofte, så denne metode kan anvendes til en række forskellige formål, fra bestemmelse af aktive områder i et genom til identificering af genrige regioner. Ved bisulfit-sekventering påvirkes methylerede cytosiner ikke af sekventeringsprocessen, mens ikke-methylerede cytosiner omdannes til uracil, et nucleotid, der normalt ikke findes i det genetiske materiale, deoxyribonucleic acid (DNA.)

Denne metode er meget følsom over for ændringer i methylering, så små ændringer i binding kan give forskerne specifik information om bestemte nukleotider. Natriumbisulfit omdanner cytosin til uracil, men omdannelsen sker i et miljø, hvor methyleret cytosin ikke vil gennemgå denne ændring. Når bisulfit-sekventering er afsluttet, er det originale DNA omdannet til et markant anderledes molekyle. Cytosiner vil blive meget udtømt eller potentielt fraværende. Hvis der stadig findes et cytosin i dette omdannede molekyle, repræsenterer det et naturligt methyleret cytosin i genomet, der undersøges.

Som alle eksperimentelle protokoller har bisulfit-sekventering ulemper. Dens vigtigste ulempe er, at det kræver en meget høj saltkoncentration for at kunne fungere korrekt. Saltet tilskynder til udglødning af enkeltstrenget DNA til dets mere naturlige dobbelt spiral, og natriumbisulfit kan ikke altid nå cytosiner, når de er en del af dobbeltstrenget DNA. Hvis saltkoncentrationen er for høj, kan et antal cytosiner muligvis ikke omdannes til uracil, hvilket resulterer i falsk identifikation af methylerede cytosiner i et genom. Denatureringsmidler kan være nødvendige for at minimere antallet af falske positive identifikationer.

Store mængder genomiske data er ikke nødvendige til bisulfit-sekventering, så fremgangsmåden har en nyttig anvendelse til analyse af kliniske prøver. Den originale nukleinsyrekilde betyder ikke noget, men kilden skal være DNA. I teorien kunne ribonukleinsyre (RNA) sekventeres ved hjælp af denne metode, da det meste RNA er enkeltstrenget og ikke ville være så modtageligt for falske positiver på grund af blokerede nukleotider. Når de implementeres, er bisulfit-sekventering imidlertid ikke nyttig for RNA, fordi RNA naturligt har uracil i sig. Uden en slags ekstern mærkning eller tilføjelse til protokollen ville konverterede cytosiner ikke kunne skelnes fra naturlig uracil.

Når der foretages nogen form for sekventeringsmetodik, er nøjagtighed og præcision afgørende. Følsomme metoder som bisulfit-sekventering tilbyder et pålideligt middel til sekvensanalyse, som igen muliggør genanalyse og identifikation af mål for lægemidler og terapier. Selvom denne metode ikke kan bruges på levende mennesker, kan den stadig være til stor hjælp med kun de mindste vævsprøver at arbejde med.