Comment le niveau de phosphorylation est-il déterminé?
Le niveau de phosphorylation de molécules ou de substances organiques est déterminé par deux méthodes: le Western blotting et la spectrométrie de masse. La phosphorylation désigne le plus souvent l'attachement d'un phosphate à une protéine. Lorsque les phosphates s'attachent aux protiens, les processus et fonctions naturels des enzymes protéiques dans le corps humain sont perturbés. Déterminer le niveau de phosphorylation est crucial pour traiter un large éventail de maladies, du cancer au diabète.
Le Western Blot est une méthode couramment utilisée pour déterminer le niveau de phosphorylation d'un ensemble particulier de protéines. Des anticorps tels que des anticorps monoclonaux anti-phospho-tyrosine sont généralement utilisés car ils se lient facilement aux résidus tyrosine d'une protéine, qui sont affectés par la phosphorylation. Dans le Western Blot, les protéines sont d'abord séparées par taille en utilisant une méthode de charge électrique appelée électrophorèse sur gel.
Les protéines sont ensuite transférées sur une membrane recouverte d'anticorps spéciaux se liant aux phosphates sur les protéines. Une fois les protéines transférées, les anticorps vont adhérer à toutes les protéines avec un phosphate lié. Le niveau de phosphorylation peut ensuite être déterminé par une radiographie de la membrane. Toute protéine affectée émettra un éclair, ce qui permettra au chercheur de mesurer plus facilement les niveaux de phosphorylation.
La spectrométrie de masse est un autre moyen de mesurer le niveau de phosphorylation d'une substance. Ce processus convertit les molécules de protéines en ions, ce qui les rend plus faciles à suivre et à mesurer. L'échantillon est ionisé par une source d'ions de grande puissance qui l'inonde d'électrons. Cette action transforme l'échantillon en cations, des ions chargés positivement.
L'analyseur de masse du spectromètre de masse sépare les ions par leur masse et leur intensité de charge. Cela permet au chercheur de découvrir le rapport masse / charge, ce qui est essentiel pour déterminer le niveau de phosphorylation de l'échantillon. Enfin, le détecteur mesure les ions dans l’ordre afin que les données puissent être affichées sous forme de graphique. Le graphique montre le rapport masse / charge des ions sur l’axe des x et l’intensité relative des ions sur l’axe des y.
Les niveaux de phosphorylation peuvent également être mesurés pendant la phosphorylation du substrat. La phosphorylation du substrat est un processus qui crée de l'adénosine triphosphate (ATP), une molécule essentielle au transfert d'énergie entre les cellules, au cours de la glycolyse. Ce processus se produit à la fois dans les cellules animales et les cellules végétales.
Dans les cellules végétales, les molécules d’ATP sont créées en utilisant l’énergie du soleil. Cette énergie stimule la phosphorylation dans les chloroplastes de la plante, site de la photosynthèse de la plante. Le niveau de phosphorylation est corrélé à la quantité de phosphate nécessaire pour créer des molécules d'ATP supplémentaires.