Che cos'è il rilevamento ELISA?
Un saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) è un test eseguito in un laboratorio di immunologia per determinare i livelli di proteine in un campione biologico. Il rilevamento ELISA si riferisce alla fase finale del test in cui una soluzione limpida, o substrato, viene aggiunta a una piastra di plastica contenente un anticorpo marcato con enzima. L'enzima taglia il substrato e si verifica un cambiamento di colore. L'assorbanza alla luce della soluzione colorata finale viene quindi misurata su un lettore di piastre ELISA o uno spettrofotometro.
Esistono vari tipi di test ELISA, i due più comuni sono ELISA indiretto e ELISA a cattura o sandwich. L'ELISA indiretto viene utilizzato per rilevare una proteina, nota come anticorpo, nel siero di un paziente. Un esempio di test ELISA indiretto è il test del virus dell'immunodeficienza umana (HIV) utilizzato per rilevare anticorpi contro l'HIV. Il test ELISA sandwich rileva una proteina, o antigene, catturandola tra due anticorpi. Il rilevamento dell'ormone gonadotropina corionica umana (hCG), elevato durante la gravidanza, viene effettuato con un test ELISA a sandwich.
Entrambi i test hanno una fase di rilevazione ELISA alla fine del test. Questo passaggio prevede l'aggiunta di un anticorpo a cui è attaccata una molecola di enzima. Dopo l'aggiunta dell'anticorpo marcato con enzima, viene aggiunta una soluzione incolore, contenente la molecola di substrato specifica per quell'enzima. L'enzima scinde la molecola del substrato e la soluzione cambia colore a seconda della combinazione utilizzata. La determinazione della quantità di anticorpo o antigene nel campione del paziente viene effettuata misurando l'intensità della variazione di colore.
Esistono diverse combinazioni di substrato enzimatico disponibili per l'uso nella fase di rilevazione ELISA. L'enzima più comune è la perossidasi di rafano (HRP), che può scindere le molecole di substrato ortofenilendiammina dicloridrato (OPD) e tetrametilbenzidina (TMB), tra gli altri. La scissione di OPD e TMB si traduce in un colore giallo e la densità ottica o l'assorbanza della luce di questi substrati viene misurata da un lettore di piastre ELISA. L'assorbanza della luce di OPD è misurata a una lunghezza d'onda di 490 nanometri (nm) mentre TMB è misurata a 450 nm.
Un altro enzima comune utilizzato nella fase di rilevazione ELISA è la fosfatasi alcalina. Questo enzima viene utilizzato con il substrato p-nitrofenil fosfato (PNPP) e produce anche una soluzione gialla. PNPP assorbe la luce a una lunghezza d'onda di 405 nm.
La selezione delle combinazioni di substrato enzimatico di solito si basa su quali anticorpi marcati con enzima sono disponibili in commercio, nonché su quali apparecchiature verranno utilizzate per misurare l'assorbanza della luce. Le numerose combinazioni disponibili per il rilevamento ELISA rendono il test ELISA estremamente versatile. È uno strumento importante nei laboratori di test e ricerca sulle malattie.