Cos'è il sequenziamento del fucile?
Il sequenziamento del fucile da caccia è un metodo di sequenziamento del DNA in base al quale un lungo tratto di DNA viene suddiviso fisicamente in piccoli frammenti (circa 2.000 coppie di basi) che vengono clonati, sequenziati e assemblati mediante analisi al computer. È stato sviluppato e reso famoso da Craig Venter di Celera Corporation. Venter ha sviluppato la tecnica nel 1996 mentre lavorava all'Institute for Genome Research.
Venter ha fondato Celera nel 1998 con la missione di sequenziare il genoma umano entro tre anni. Questo obiettivo era in diretta concorrenza con il già attivo Human Genome Project, un consorzio di università che lavoravano insieme per sequenziare il genoma umano usando una strategia più vecchia chiamata sequenziamento da BAC a BAC. Questo metodo prevedeva innanzitutto la suddivisione del genoma in 150.000 pezzi di coppie di basi chiamati BAC, assemblando i BAC in ordine e quindi sequenziando ogni BAC in dettaglio.
Il sequenziamento del fucile a tutto genoma ignora la creazione e la mappatura dei BAC e inizia proprio con il sequenziamento del DNA. Il processo inizia con l'acquisizione di un campione di DNA ad alto peso molecolare dall'organismo di interesse e la sua rottura fisica in piccoli pezzi facendolo passare attraverso una siringa a scartamento ridotto o sonicandolo, un modo per rompere il campione usando le onde sonore. La cesoiatura è un processo casuale, quindi le sequenze dei frammenti si sovrapporranno. La cesoiatura non crea specificamente i 2.000 frammenti di coppie di basi necessari per il sequenziamento, ma i frammenti della dimensione desiderata devono essere purificati dalla miscela.
Il prossimo passo è unire i frammenti di DNA con il DNA vettore chiamato un vettore. Questo processo è noto come clonazione e crea una libreria di sequenziamento da cui verrà creata la sequenza di un intero genoma. Viene determinata la sequenza di ciascun clone nella libreria e l'analisi al computer viene utilizzata per trovare sovrapposizioni o sequenze continue in ciascun frammento. Il montaggio delle sovrapposizioni crea un "contig", che è un lungo tratto continuo di sequenza del DNA.
La clonazione del fucile da caccia di solito si traduce in alcune lacune tra i contig perché alcune sequenze mancano per caso dalla libreria. Gli spazi vuoti possono essere colmati creando una nuova libreria o usando sequenze note per estendersi verso l'esterno dalla configurazione. Poiché il sequenziamento del fucile a sequenza sequenzia i frammenti di DNA in modo casuale, molti frammenti vengono sequenziati più di una volta, creando una maggiore certezza che la sequenza è corretta rispetto a se ogni frammento fosse stato sequenziato solo una o due volte.
Il genoma umano è stato sequenziato sia dal Progetto genoma umano usando il sequenziamento basato su mappe sia da Celera usando il sequenziamento di fucili da caccia. Il sequenziamento del fucile è ora il metodo preferito per altri tipi di sequenziamento del genoma. L'intero genoma di molti organismi, come la pianta Arabidopsis thaliana , il riso, la mucca, il cane, il pollo, lo scimpanzé, il ratto, il topo, il pesce palla e molti microrganismi sono stati sequenziati in questo modo.