Cos'è la tecnica di ibridazione fluorescente in situ?
L'ibridazione in situ fluorescente, nota anche come ibridazione in situ a fluorescenza, è più comunemente definita FISH. È una tecnica che prevede l'utilizzo di un breve filamento di DNA marcato con un colorante fluorescente per rilevare anomalie genetiche. FISH consente agli investigatori di visualizzare cromosomi, parti di cromosomi o geni specifici in modo rapido e preciso. Questo è spesso usato per determinare la prognosi e il trattamento di alcune malattie, in particolare i tumori.
FISH viene utilizzato per determinare se i cromosomi hanno anomalie. Ciò può includere delezioni cromosomiche, riarrangiamenti o traslocazioni, in cui due cromosomi hanno scambiato segmenti. FISH consente inoltre agli investigatori di visualizzare geni specifici. Può determinare se è presente un certo gene, dove si trova sui cromosomi e se sono presenti copie multiple. Questo si chiama mappatura genica.
La composizione genetica di una persona è contenuta nel loro DNA, che si trova nei nuclei di tutte le loro cellule. Il DNA ha due filoni complementari. In altre parole, hanno molecole chiamate coppie di basi che corrispondono esattamente. I geni sono segmenti di DNA che hanno una particolare sequenza di coppie di basi e si trovano su aree specifiche dei cromosomi. I geni vengono ereditati e determinano il funzionamento delle cellule, ma possono anche essere mutati se cambia la sequenza delle coppie di basi del DNA.
La tecnica di ibridazione in situ fluorescente sfrutta la natura complementare dei filamenti di DNA. Gli investigatori prima creano una sonda. Questo è un singolo filamento di DNA complementare alla sequenza genetica che lo sperimentatore sta cercando. La sonda viene quindi etichettata o attaccata a un colorante fluorescente.
Le cellule del tessuto malato, come una biopsia tumorale, di solito costituiscono il campione che deve essere esaminato dal FISH. Il campione viene riscaldato per denaturare il DNA nei nuclei delle cellule. Ciò significa che i doppi filamenti di DNA nelle cellule del campione si rompono per formare singoli filamenti. Una sonda FISH specifica viene quindi ibridata con il campione. In altre parole, viene introdotto il singolo filo della sonda e si fonde con il suo singolo filo gratuito nelle celle campione denaturate.
Usando uno speciale microscopio a fluorescenza, il ricercatore esamina il campione. Se il gene o il cromosoma specifico è presente nelle cellule del campione, apparirà come una luce fluorescente su uno sfondo più scuro. I ricercatori possono facilmente vedere se il gene è presente o meno, e se lo è, quante copie del gene sono presenti in ciascuna cellula. Se il ricercatore sta cercando la posizione di un gene, può vedere dove si trova il cromosoma. Un normale microscopio ottico non può essere utilizzato con FISH, poiché il colorante fluorescente emette un livello di luce molto basso.
L'uso dell'ibridazione del DNA con le sonde fu realizzato per la prima volta negli anni '60; tuttavia, le sonde sono state etichettate con sostanze radioattive anziché fluorescenti. Ciò ha avuto diversi problemi. Le sostanze radioattive sono intrinsecamente instabili, pericolose e richiedono protocolli speciali per lo smaltimento. Ci vuole anche molto tempo per misurare il segnale radioattivo emesso dalla sonda ibrida. La tecnica di ibridazione in situ fluorescente supera la maggior parte di questi ostacoli.
Se gli investigatori sanno quale gene stanno cercando, FISH è veloce e preciso nel trovarlo. FISH può anche essere eseguito anche se le cellule non si dividono attivamente e fornisce informazioni più specifiche sulle anomalie nei cromosomi. Tecniche più convenzionali, come il karotyping, dicono semplicemente agli investigatori il numero e la dimensione dei cromosomi all'interno di una cellula.
L'ibridazione in situ fluorescente presenta degli svantaggi. Poiché la chiave di FISH è conoscere la sequenza della coppia di basi e / o la posizione di un gene, non può essere utilizzato come strumento di screening generale. È anche più costoso di altre tecniche meno specifiche e potrebbe non essere disponibile in tutti i laboratori o ospedali.
I vantaggi e gli svantaggi dell'ibridazione in situ fluorescente sono meglio descritti dall'esempio. FISH viene utilizzato abitualmente nella diagnosi del carcinoma mammario per determinare se un paziente ha più copie di un gene chiamato HER2. Questo di solito indica una forma più aggressiva di cancro al seno e che il paziente dovrebbe ricevere determinati farmaci come parte del loro trattamento. FISH può essere usato per questo perché sono note la sequenza della coppia di basi e la posizione cromosomica del gene HER2. Al contrario, FISH non può essere utilizzato per determinare quali geni o geni sconosciuti hanno causato il cancro al seno o per lo screening per il cancro al seno in generale.