Come viene determinato il livello di fosforilazione?

Il livello di fosforilazione di molecole o sostanze organiche è determinato da due metodi: Western Blot e spettrometria di massa. La fosforilazione si riferisce più spesso all'attaccamento di un fosfato alle proteine. Quando i fosfati si attaccano ai protieni, i processi e le funzioni naturali degli enzimi proteici all'interno del corpo umano sono disturbati. Determinare il livello di fosforilazione è fondamentale per il trattamento di una vasta gamma di malattie, dal cancro al diabete.

La western blotting è un metodo popolare utilizzato per determinare il livello di fosforilazione di un particolare insieme di proteine. Gli anticorpi come gli anticorpi monoclonali anti-fosfo-tirosina sono tipicamente usati perché si legano facilmente ai residui di tirosina di una proteina, che sono influenzati dalla fosforilazione. Nella western blotting, le proteine ​​vengono prima separate per dimensione usando un metodo di carica elettrica noto come elettroforesi su gel.

Le proteine ​​vengono quindi trasferite su una membrana che è stata coperta con anticorpi speciali che si legano ai fosfati sulle proteine. Una volta trasferite le proteine, gli anticorpi si attaccano a qualsiasi proteina con un fosfato attaccato. Il livello di fosforilazione può quindi essere determinato da una radiografia della membrana. Qualsiasi proteina interessata emetterà un lampo di luce, rendendo più facile per il ricercatore misurare i livelli di fosforilazione.

La spettrometria di massa è un altro modo per misurare il livello di fosforilazione di una sostanza. Questo processo converte le molecole proteiche in ioni, il che le rende più facili da tracciare e misurare. Il campione è ionizzato da una sorgente di ioni ad alta potenza che inonda il campione di elettroni. Questa azione trasforma il campione in cationi, ioni caricati positivamente.

L'analizzatore di massa dello spettrometro di massa separa gli ioni dalla loro massa e intensità di carica. Ciò consente al ricercatore di scoprire il rapporto massa-carica, che è fondamentale per scoprire il livello di fosforilazione del campione. Infine, il rilevatore misura gli ioni in modo che i dati possano essere visualizzati sotto forma di grafico. Il grafico mostra il rapporto massa-carica degli ioni sull'asse xe l'intensità relativa degli ioni sull'asse y.

I livelli di fosforilazione possono anche essere misurati durante la fosforilazione del substrato. La fosforilazione del substrato è un processo che crea adenosina trifosfato (ATP), una molecola fondamentale per il trasferimento di energia tra le cellule, durante la glicolisi. Questo processo si verifica sia nelle cellule animali che nelle cellule vegetali.

Nelle cellule vegetali, le molecole di ATP vengono create utilizzando l'energia del sole. Questa energia stimola la fosforilazione nei cloroplasti della pianta, il sito della fotosintesi della pianta. Il livello di fosforilazione è correlato alla quantità di fosfato necessaria per creare ulteriori molecole di ATP.