Wat is een Northern Blot?
Northern-blothybridisatie is een techniek die wordt gebruikt om niveaus van messenger RNA (mRNA) in een monster te detecteren en om de hoeveelheid aanwezig mRNA te kwantificeren. Hoewel er andere krachtigere technieken bestaan, blijft Northern Blot de standaard vanwege zijn eenvoud en gebruiksgemak. De Northern-blottechniek maakt ook directe vergelijking van meerdere monsters in één experiment mogelijk.
Messenger RNA is een type nucleïnezuur dat wordt geproduceerd wanneer een gen tot expressie wordt gebracht. Een gen dat is ingeschakeld en functioneel in een cel is getranscribeerd in mRNA. Het mRNA wordt vervolgens getransporteerd naar het cytoplasma van de cel, waar het wordt omgezet in een eiwit. Northern-blotanalyse van een cellulair mRNA-monster kan daarom nuttige informatie verschaffen over de reeks eiwitten die de cel produceert.
In een Northern-blot wordt mRNA uit cellen geëxtraheerd en door een denaturerende agarosegelelektroforese geleid, waardoor mRNA in het monster naar grootte kan worden gescheiden. Monsters van mRNA-moleculen met bekende afmetingen worden tegelijkertijd uitgevoerd om een controle te verschaffen. Nadat de elektroforese voltooid is, worden de monsters overgebracht en geïmmobiliseerd op een vast membraan, typisch gemaakt van een materiaal zoals nylon. De monsters worden vervolgens enkele uren voorafgaand aan analyse blootgesteld aan radioactief gelabelde probes. Tijdens de analyse kan mRNA dat is gehybridiseerd met een radioactief gemerkte probe duidelijk worden gedetecteerd met behulp van röntgenstralen.
De Northern-blottechniek zorgt voor de observatie van genexpressiepatronen tussen verschillende weefseltypen. Messenger RNA geëxtraheerd uit cellen van verschillende weefsels en orgeltypen kunnen worden vergeleken en cellulaire reacties op stress, infectie en vele andere stimuli kunnen worden onderzocht. Door te kijken naar verschillen in mRNA-expressie onder verschillende omstandigheden, kan een wetenschapper bepalen welke soorten eiwitten een cel produceert als reactie op bepaalde stimuli. Dit kan aanwijzingen geven over functies van onbekende eiwitten, of, in het geval van bekende eiwitten, informatie over cellulaire reacties op de desbetreffende stimuli.
Een Northern-blot kan bijvoorbeeld aantonen dat de expressie van een onbekend eiwit toeneemt als reactie op de aanwezigheid van een specifiek toxine. Men zou dan kunnen theoretiseren dat het eiwit betrokken is bij het verminderen van toxiciteit, misschien door de chemische stof uit de cel te transporteren of het om te zetten in een metaboliet. Als bekende eiwitten worden onderzocht, kan het documenteren van veranderingen in de eiwitexpressie informatie geven over de reactie zelf. Als de expressie van een bekende moleculaire transporter bijvoorbeeld werd verhoogd, kon worden bevestigd dat de cellulaire reactie op het toxine is om het toxine uit de cel te transporteren.