Wat is een polymerase kettingreactie?

De polymerasekettingreactie (PCR) maakt gebruik van enzymen om een ​​deel van een deoxyribonucleïnezuur (DNA) streng in massa te repliceren voor eenvoudiger analyse, zoals het zoeken naar interessante genen. Net als de nucleaire kettingreactie is de polymerasekettingreactie een exponentieel proces dat doorgaat zolang de grondstoffen voor het aanhouden van de reactie beschikbaar zijn. In tegenstelling tot DNA-replicatie in de natuurlijke wereld, kan de polymerasekettingreactie alleen vrij kleine stukjes DNA repliceren, met een bovenplafond van ongeveer 2-3 kilo basenparen (kb). Een polymerasekettingreactie maakt gebruik van levenloze enzymen om het replicatie-effect te bewerkstelligen, waardoor het zich onderscheidt van andere kopieerbenaderingen die actieve organismen gebruiken.

Een moderne polymerasekettingreactie vereist zes basiscomponenten om te werken: het te kopiëren DNA-segment, primers om het segment af te bakenen, Taq-polymerase om te kopiëren, DNA-nucleotiden om te dienen als grondstof, een chemische bufferomgeving en een machine die een thermische wordt genoemd fietser. De thermische cycler bevat vaak meerdere reageerbuizen met meerdere polymerasekettingreacties, die elk 15 tot 100 microliter bevatten, waarden net onder een kubieke millimeter water. Ongeveer honderd nanogram DNA-base wordt gebruikt.

Taq-polymerase, het sleutelingrediënt voor een polymerasekettingreactie, wordt geëxtraheerd uit een diepzee, thermische vent-woonbacterie, Thermus aquaticus . Het werkt goed voor het kopiëren, maar niet perfect, en maakt ongeveer één keer per 8 miljoen baseparen een fout. Voordat Taq-polymerase werd gebruikt, werden andere polymerasen gebruikt, maar veel daarvan braken af ​​bij de noodzakelijke temperaturen om de reactie te laten beginnen. De verwarmingscyclus is ingewikkeld, maar omvat temperaturen die zich bijna helemaal tot het kookpunt uitstrekken, dus duurzaamheid in het polymerase is essentieel.

De basisstappen van de polymerasekettingreactie zijn als volgt. Alle ingrediënten worden samen gemengd in een kleine injectieflacon, meestal met een volume van 200 microgram. Het mengsel wordt verwarmd tot bijna kookpunt om de waterstofbruggen in het paarstrengige DNA te verbreken, waardoor enkele strengen ontstaan ​​die gevoelig zijn voor kopiëren. Dit wordt denaturering genoemd . Hoe langer de te kopiëren streng, hoe langer het denatureringsproces duurt.

De volgende stap in de polymerasekettingreactie wordt gloeien genoemd . De primers, op maat gemaakte, korte DNA-strengen, zijn specifiek ontworpen om te binden aan plaatsen aan het begin en einde van het te kopiëren segment. Als de primers onjuist zijn ontworpen of de temperatuur in dit stadium verkeerd is, zal de primer willekeurig binden aan het DNA, wat resulteert in de kopie van het verkeerde segment. De meeste primers smelten op ongeveer tweederde van het kookpunt en gloeien, een proces van 1-2 minuten, vindt plaats op een paar graden hieronder.

De laatste stappen in de polymerasekettingreactie worden extensie en laatste extensie genoemd . Dit is waar de magie gebeurt. De polymerase kopieert het DNA-segment snel, waardoor miljoenen en miljoenen kopieën in slechts enkele minuten worden gemaakt. Gewoonlijk bestaat een cyclus uit alle voorgaande stappen, die ongeveer twintig of dertig keer worden herhaald.

Het resultaat is een hoop gekopieerd DNA. Polymerase kettingreacties kunnen op verschillende manieren worden gebruikt, waaronder vaderschapstests, het bepalen van de aanwezigheid of afwezigheid van een genetisch defect of viraal DNA, het klonen van een gen, het introduceren van specifieke mutaties, het analyseren van het DNA van uitgestorven soorten of dode personen, "genetische vingerafdrukken" bij de plaats delict en meer.