Wat is een recombinant plasmide?

Een plasmide is een cirkelvormig stuk DNA dat in veel bacteriën voorkomt. Het meest opvallende kenmerk van plasmiden is dat ze onafhankelijk van het hoofd-DNA van de gastheer repliceren. Vaak wordt een plasmide gebruikt in recombinante kloneringstechnologie om nieuw geïsoleerde genen te klonen. Het is ook heel gebruikelijk om een ​​recombinant plasmide te gebruiken om grote hoeveelheden van een bekend gen tot expressie te brengen om daaruit RNA of eiwit te verkrijgen. Een dergelijke recombinante genexpressie is onmisbaar voor de biotechnologie-industrie.

Recombinante plasmiden werden eerst ontwikkeld in de laboratoriumrat van de bacteriële wereld, Escherichia coli . Veel andere soorten bacteriën kunnen dergelijke plasmiden herbergen. Deze stukjes zelfreplicerend DNA kunnen op natuurlijke wijze worden overgedragen tussen verschillende soorten bacteriën. Ondanks dit was het soms moeilijk om de recombinante plasmiden in andere soorten bacteriën te introduceren.

De primaire procedure voor het introduceren van DNA in andere cellen staat bekend als transformatie, waarbij de bacteriën worden behandeld met chemicaliën waardoor ze sneller vreemd DNA opnemen. Een andere techniek omvat het shockeren van de bacteriën met een elektrische stroom. Dit staat bekend als elektroporatie.

Redenen voor het creëren van een recombinant plasmide variëren. Vaak wanneer DNA voor het eerst wordt geïsoleerd uit een bepaald weefsel of organisme, wordt het omgezet in plasmiden om een ​​bibliotheek te creëren. Vervolgens kan DNA uit afzonderlijke kolonies worden geëxtraheerd. Vervolgens kunnen ze worden gescreend door DNA-sequentiebepaling om te bepalen welke soorten genen aanwezig zijn, als de sequenties aanwezig zijn in een database. Soms worden genen met onbekende functies gekloond.

In andere gevallen is het genproduct bekend, maar de onderzoekers willen grote hoeveelheden ervan uitdrukken voor verder onderzoek. Het gen kan worden gekloneerd in recombinante plasmiden die overexpressievectoren zijn. Ze zijn speciaal ontworpen om grote hoeveelheden RNA of eiwit te produceren. Dit is vooral waardevol geweest voor recombinante menselijke eiwitten, die voorheen vaak alleen verkrijgbaar waren bij kadavers, waardoor het erg moeilijk was om de functie van een bepaald gen te bestuderen.

Verschillende factoren zijn betrokken bij het construeren van een plasmide dat kan worden gebruikt bij moleculair klonen. Het plasmide moet een selecteerbare marker hebben. Dit maakt het mogelijk om een ​​cel met het gen te selecteren. Normaal gesproken overtreft de populatie cellen die het gen met de marker missen, het aantal cellen dat het draagt ​​aanzienlijk. In het algemeen heeft een recombinant plasmide resistentie tegen een antibioticum of kan groeien in afwezigheid van een bepaald aminozuur.

Zo'n plasmide heeft een replicatieoorsprong nodig, zodat het kan beginnen zijn recombinant DNA te synthetiseren. Bovendien vereist een recombinant plasmide een reeks speciale sequenties om het mogelijk te maken dat een restrictie-enzym het DNA splitst zodat een gen in de kloneringsvector kan worden ingevoegd. Er is een groot aantal restrictie-enzymen die zeer gespecialiseerd zijn voor specifieke DNA-sequenties die aanwezig moeten zijn waar het gen begint en eindigt.

Traditionele bacteriestammen worden al tientallen jaren gebruikt voor het klonen van DNA. Bovendien zijn er nieuwe kits die speciaal geconstrueerde bacteriestammen gebruiken om overexpressie van het genproduct te vergemakkelijken. Ze combineren de technologie voor het kloneren van een gen met een methode die eenvoudige zuivering mogelijk maakt van het eiwit dat uit het gen tot expressie wordt gebracht zodra het in het recombinante plasmide is gekloneerd.