Co to jest wykrywanie ELISA?
Test immunoenzymatyczny (ELISA) to test przeprowadzony w laboratorium immunologicznym w celu ustalenia poziomów białka w próbce biologicznej. Wykrywanie ELISA odnosi się do ostatniego etapu testu, w którym klarowny roztwór lub substrat jest dodawany do plastikowej płytki zawierającej związane przeciwciało znakowane enzymem. Enzym rozszczepia substrat i następuje zmiana koloru. Absorbancję światła końcowego zabarwionego roztworu mierzy się następnie na czytniku płytek ELISA lub spektrofotometrze.
Istnieją różne rodzaje testów ELISA, z których dwa najczęściej są testem pośrednim ELISA i testem ELISA na wychwytywanie lub kanapkę. Pośredni test ELISA służy do wykrywania białka, zwanego przeciwciałem, w surowicy pacjenta. Przykładem pośredniego testu ELISA jest test ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV) stosowany do wykrywania przeciwciał przeciwko HIV. Test kanapkowy ELISA wykrywa białko lub antygen, przechwytując je między dwoma przeciwciałami. Wykrywanie hormonu ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (hCG), podwyższonego podczas ciąży, wykonuje się za pomocą testu ELISA typu sandwich.
Oba testy mają etap wykrywania ELISA na końcu testu. Ten etap obejmuje dodanie przeciwciała, do którego jest dołączona cząsteczka enzymu. Po dodaniu przeciwciała znakowanego enzymem dodaje się bezbarwny roztwór zawierający cząsteczkę substratu swoistą dla tego enzymu. Enzym rozszczepia cząsteczkę substratu, a roztwór zmienia kolor w zależności od zastosowanej kombinacji. Określenie ilości przeciwciała lub antygenu w próbce pacjenta wykonuje się poprzez pomiar intensywności zmiany koloru.
Istnieje kilka kombinacji enzymatycznych substratów do zastosowania w etapie wykrywania ELISA. Najczęstszym enzymem jest peroksydaza chrzanowa (HRP), która może rozszczepiać między innymi cząsteczki substratu - dichlorowodorek orto-fenylenodiaminy (OPD) i tetrametylobenzydynę (TMB). Odszczepienie zarówno OPD, jak i TMB daje żółty kolor, a gęstość optyczną lub absorbancję światła tych substratów mierzy się za pomocą czytnika płytek ELISA. Absorbancję światła OPD mierzy się przy długości fali 490 nanometrów (nm), podczas gdy TMB mierzy się przy 450 nm.
Innym powszechnym enzymem stosowanym w etapie wykrywania ELISA jest fosfataza alkaliczna. Enzym ten stosuje się z substratem fosforan p-nitrofenylu (PNPP), a także wytwarza żółty roztwór. PNPP pochłania światło o długości fali 405 nm.
Wybór kombinacji substratów enzymatycznych jest zwykle oparty na tym, jakie przeciwciała znakowane enzymem są dostępne w handlu, a także na jakim sprzęcie zostanie zastosowany do pomiaru absorbancji światła. Liczne kombinacje dostępne do wykrywania ELISA sprawiają, że test ELISA jest bardzo wszechstronny. Jest to ważne narzędzie w badaniach chorób i laboratoriach badawczych.