Co to jest wykrywanie ELISA?

Powiązany enzym test immunosorbent (ELISA) jest testem przeprowadzonym w laboratorium immunologicznym w celu ustalenia poziomów białka w próbce biologicznej. Wykrywanie ELISA odnosi się do ostatniego etapu testu, w którym przezroczysty roztwór lub substrat jest dodawany do plastikowej płyty zawierającej związane przeciwciało znakowane enzymem. Enzym rozszczepia podłoże i zachodzi zmiana koloru. Absorbancja światła końcowego kolorowego roztworu jest następnie mierzona na czytniku płyt ELISA lub spektrofotometrze.

Istnieją różne rodzaje testów ELISA, przy czym dwa najczęstsze to pośrednia ELISA i przechwytywanie lub kanapka, ELISA. Pośrednia ELISA służy do wykrywania białka znanego jako przeciwciało, w surowicy pacjenta. Przykładem pośredniego testu ELISA jest test ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV) zastosowany do wykrywania przeciwciał przeciwko HIV. Test kanapki ELISA wykrywa białko lub antygen, chwytając je między dwoma przeciwciałami. Wykrywanie hormonu ludzkiego gonadotropiny na kosmków (HCG), czyli ELewated podczas ciąży odbywa się za pomocą testu ELISA kanapki.

Oba testy mają etap wykrywania ELISA na końcu testu. Ten krok obejmuje dodanie przeciwciała, który ma do niego przymocowaną cząsteczkę enzymatyczną. Po dodaniu przeciwciała znakowanego enzymem dodaje się bezbarwny roztwór zawierający cząsteczkę substratu specyficzną dla tego enzymu. Enzym rozszczepia cząsteczkę substratu, a roztwór zmienia kolor w zależności od zastosowanej kombinacji. Określenie ilości przeciwciał lub antygenu w próbce pacjenta odbywa się poprzez pomiar intensywności zmiany koloru.

Istnieje kilka kombinacji substratu enzymu dostępnych do zastosowania w etapie wykrywania ELISA. Najczęstszym enzymem jest peroksydaza chrzanowa (HRP), która może rozszczepić między innymi cząsteczki podłoża orto-fenylenodiaminy (OPD) i tetrametylobenzydyna (TMB). Dekolt obu OPDa TMB powoduje żółty kolor, a gęstość optyczna lub absorbancja światła tych substratów mierzy się przez czytnik płyt ELISA. Absorbancja światła OPD mierzy się przy długości fali 490 nanometrów (nm), podczas gdy TMB mierzy się przy 450 nm.

Innym wspólnym enzymem stosowanym w etapie wykrywania ELISA jest fosfataza alkaliczna. Ten enzym jest stosowany z fosforanem p-nitrofenylu podłoża (PNPP), a także wytwarza żółty roztwór. PNPP pochłania światło o długości fali 405 nm.

Wybór kombinacji substratu enzymu jest zwykle oparty na tym, jakie przeciwciała znakowane enzymem są dostępne w handlu, a także na tym, jakie sprzęt zostanie użyty do pomiaru absorbancji światła. Wiele dostępnych kombinacji do wykrywania ELISA sprawia, że ​​test ELISA jest bardzo wszechstronny. Jest to ważne narzędzie w laboratoriach testowych i badawczych.