Co to jest Northern Blot?
Hybrydyzacja metodą Northern blot jest techniką stosowaną do wykrywania poziomów informacyjnego RNA (mRNA) w próbce i do oznaczania ilości mRNA, które jest obecne. Chociaż istnieją inne bardziej zaawansowane techniki, Northern Blot pozostaje standardem ze względu na swoją prostotę i łatwość użycia. Technika Northern blotting pozwala również na bezpośrednie porównanie wielu próbek w jednym eksperymencie.
Posłaniec RNA jest rodzajem kwasu nukleinowego, który powstaje podczas ekspresji genu. Gen, który jest włączony i funkcjonuje w komórce, jest transkrybowany do mRNA. Następnie mRNA jest transportowany do cytoplazmy komórki, gdzie ulega translacji do białka. Analiza Northern błot próbki komórkowej mRNA może zatem dostarczyć użytecznych informacji na temat szeregu białek wytwarzanych przez komórkę.
W analizie Northern blot mRNA jest ekstrahowany z komórek i przepuszczany przez elektroforezę denaturującego żelu agarozowego, co pozwala na rozdzielenie mRNA w próbce zgodnie z rozmiarem. Próbki cząsteczek mRNA o znanych rozmiarach pobiera się w tym samym czasie, aby zapewnić kontrolę. Po zakończeniu elektroforezy próbki są przenoszone i unieruchamiane na stałej błonie, zwykle wykonanej z materiału takiego jak nylon. Próbki są następnie eksponowane na znakowane radioaktywnie sondy przez kilka godzin przed analizą. Podczas analizy mRNA, który zhybrydyzował z sondą znakowaną radioaktywnie, można wyraźnie wykryć za pomocą promieniowania rentgenowskiego.
Technika Northern blotting pozwala na obserwację wzorców ekspresji genów między różnymi typami tkanek. Posłaniec RNA wyekstrahowany z komórek różnych tkanek i typów narządów można porównać, a także odpowiedzi komórkowe na stres, infekcję i wiele innych bodźców. Analizując różnice w ekspresji mRNA w różnych warunkach, naukowiec może określić, jakie rodzaje białek wytwarza komórka w odpowiedzi na niektóre bodźce. Może to dostarczyć wskazówek na temat funkcji nieznanych białek lub, w przypadku znanych białek, informacji na temat odpowiedzi komórkowych na dane bodźce.
Na przykład, Northern blot może wykazać, że ekspresja nieznanego białka wzrasta w odpowiedzi na obecność konkretnej toksyny. Można by teoretyzować, że białko bierze udział w zmniejszaniu toksyczności, być może poprzez transport substancji chemicznej z komórki lub przekształcenie jej w metabolit. Jeśli badane są znane białka, dokumentowanie zmian w ekspresji białka może dostarczyć informacji o samej odpowiedzi. Jeśli na przykład zwiększy się ekspresja znanego transportera molekularnego, można potwierdzić, że odpowiedzią komórkową na toksynę jest transport toksyny z komórki.