Co to jest rekombinowany plazmid?
Plazmid jest okrągłym kawałkiem DNA, który występuje w wielu bakteriach. Najbardziej godną uwagi cechą plazmidów jest to, że powtarzają one niezależnie od głównego DNA gospodarza. Często plazmid jest stosowany w rekombinowanej technologii klonowania w celu klonowania nowo izolowanych genów. Bardzo często stosowanie rekombinowanego plazmidu do wyrażania dużych ilości znanego genu w celu uzyskania z niego RNA lub białka. Taka rekombinowana ekspresja genów była niezbędna dla branży biotechnologii.
rekombinowane plazmidy zostały po raz pierwszy opracowane na szczurze laboratoryjnym świata bakteryjnego, Escherichia coli . Wiele innych rodzajów bakterii może zawierać takie plazmidy. Te fragmenty samoreplikującego się DNA mogą naturalnie przenosić między różnymi rodzajami bakterii. Mimo to czasami trudno było wprowadzić rekombinowane plazmidy do innych rodzajów bakterii.
Podstawowa procedura wprowadzania DNA do innych komórek jest znana jako transformacja, w której bakterie są traktowane chemikaliami, które tworząBardziej prawdopodobne, że podejmą obce DNA. Inna technika polega na szokowaniu bakterii prądem elektrycznym. Jest to znane jako elektroporacja.
Przyczyny utworzenia rekombinowanego plazmidu zmieniające się. Często, gdy DNA jest po raz pierwszy izolowany z określonej tkanki lub organizmu, jest on przekształcany w plazmidy w celu tworzenia biblioteki. Następnie DNA można ekstrahować z poszczególnych kolonii. Następnie można je sprawdzić sekwencjonowaniem DNA, aby ustalić, jakie typy genów są obecne, jeśli sekwencje są obecne w bazie danych. Czasami klonowane są geny o nieznanych funkcjach.
W innych przypadkach produkt genowy jest dobrze znany, ale naukowcy chcą wyrazić duże ilości go do dalszych badań. Gen można sklonować do rekombinowanych plazmidów, które są wektorami nadekspresji. Są one specjalnie zaprojektowane w celu wytwarzania dużych ilości RNA lub białka. Było to szczególnie cenne dla rekombinowanego człowiekaBiałka, które wcześniej były często dostępne tylko w zwłokach, co bardzo utrudnia badanie funkcji określonego genu.
Kilka czynników bierze udział w konstruowaniu plazmidu, które można zastosować w klonowaniu molekularnym. Plazmid musi mieć marker wybieralny. Umożliwia to wybranie komórki z genem. Zwykle populacja komórek pozbawionych genu z markerem znacznie przewyższa liczbę komórek, które go noszą. Zasadniczo rekombinowany plazmid ma oporność na antybiotyk lub może rosnąć przy braku określonego aminokwasu.
Taki plazmid wymaga pochodzenia replikacji, aby mógł zacząć syntetyzować rekombinowane DNA. Ponadto rekombinowany plazmid wymaga zestawu specjalnych sekwencji, aby umożliwić enzym ograniczający rozszczepienie DNA, aby umożliwić wstawienie genu do wektora klonowania. Istnieje duża liczba enzymów restrykcyjnych, które są wysoce wyspecjalizowane dla określonych sekwencji DNA, które muszą być obecne tam, gdzie gensztuka i końce.
Od dziesięcioleci stosowano tradycyjne szczepy bakterii do klonowania DNA. Ponadto istnieją nowe zestawy, które wykorzystują specjalnie skonstruowane szczepy bakteryjne, aby ułatwić nadekspresję produktu genowego. Łączą technologię klonowania genu z metodą, która umożliwia łatwe oczyszczenie białka wyrażanego z genu, gdy zostanie sklonowane do rekombinowanego plazmidu.