Co to jest rekombinowany plazmid?
Plazmid to okrągły fragment DNA, który znajduje się w wielu bakteriach. Najbardziej zauważalną cechą plazmidów jest to, że replikują się one niezależnie od głównego DNA gospodarza. Często w technologii klonowania rekombinowanego stosuje się plazmid do klonowania nowo izolowanych genów. Bardzo często stosuje się rekombinowany plazmid do ekspresji dużych ilości znanego genu w celu uzyskania z niego RNA lub białka. Taka ekspresja rekombinowanego genu była niezbędna dla przemysłu biotechnologicznego.
Rekombinowane plazmidy po raz pierwszy opracowano u szczura laboratoryjnego świata bakteryjnego Escherichia coli . Wiele innych rodzajów bakterii może przenosić takie plazmidy. Te fragmenty samoreplikującego się DNA mogą naturalnie przenosić się między różnymi typami bakterii. Mimo to czasami trudno było wprowadzić rekombinowane plazmidy do innych rodzajów bakterii.
Podstawowa procedura wprowadzania DNA do innych komórek jest znana jako transformacja, w której bakterie są traktowane substancjami chemicznymi, które zwiększają prawdopodobieństwo pobrania obcego DNA. Inna technika polega na szokowaniu bakterii prądem elektrycznym. Jest to znane jako elektroporacja.
Powody tworzenia rekombinowanego plazmidu są różne. Często, gdy DNA jest najpierw izolowane z określonej tkanki lub organizmu, jest przekształcane w plazmidy w celu utworzenia biblioteki. Następnie DNA można wyodrębnić z poszczególnych kolonii. Następnie można je przeszukiwać przez sekwencjonowanie DNA w celu ustalenia, jakie typy genów są obecne, jeśli sekwencje są obecne w bazie danych. Czasami geny o nieznanych funkcjach są klonowane.
W innych przypadkach produkt genowy jest dobrze znany, ale naukowcy chcą wyrazić jego duże ilości do dalszych badań. Gen można klonować do rekombinowanych plazmidów, które są wektorami nadekspresyjnymi. Są one zaprojektowane specjalnie do wytwarzania dużych ilości RNA lub białka. Było to szczególnie cenne w przypadku rekombinowanych ludzkich białek, które wcześniej były często dostępne tylko od zwłok, co bardzo utrudnia badanie funkcji konkretnego genu.
Kilka czynników jest zaangażowanych w konstruowanie plazmidu, który można zastosować w klonowaniu molekularnym. Plazmid musi mieć marker selekcyjny. Umożliwia to wybranie komórki z genem. Zwykle populacja komórek pozbawionych genu ze znacznikiem znacznie przewyższa liczbę komórek, które go niosą. Ogólnie rekombinowany plazmid ma oporność na antybiotyk lub może rosnąć pod nieobecność określonego aminokwasu.
Taki plazmid wymaga początku replikacji, aby mógł zacząć syntezę swojego rekombinowanego DNA. Ponadto rekombinowany plazmid wymaga zestawu specjalnych sekwencji, aby umożliwić enzymowi restrykcyjnemu cięcie DNA w celu umożliwienia wstawienia genu do wektora klonującego. Istnieje duża liczba enzymów restrykcyjnych, które są wysoce wyspecjalizowane w określonych sekwencjach DNA, które muszą być obecne tam, gdzie gen zaczyna się i kończy.
Tradycyjne szczepy bakterii są wykorzystywane do klonowania DNA od dziesięcioleci. Ponadto istnieją nowe zestawy, które wykorzystują specjalnie skonstruowane szczepy bakteryjne, aby ułatwić nadekspresję produktu genowego. Łączą technologię klonowania genu z metodą, która pozwala na łatwe oczyszczenie białka wyrażanego z genu po sklonowaniu go w rekombinowanym plazmidzie.