Co to jest oczyszczanie peptydów?
Peptydy to małe polimery złożone z aminokwasów. Wiele z nich jest biologicznie aktywnych jako hormony, toksyny lub mają inne zdolności. Takie związki są często stosowane w badaniach biologicznych, medycznych i chemicznych. Służą również jako elementy budulcowe białek, gdy ich liczba jest ze sobą połączona. Oczyszczanie peptydów jest techniką stosowaną do oczyszczania dużych ilości pożądanego peptydu lub do oddzielania peptydów wytwarzanych z trawienia białek.
Oczyszczanie peptydów odbywa się za pomocą techniki chromatografii, sposobu rozdzielania związków, które w różny sposób wiążą się z matrycą fizyczną. Wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa (HPLC) jest powszechnie stosowana do oczyszczania peptydów. Peptyd lub peptydy stosuje się w mieszaninie rozpuszczalników, która zmienia się w czasie, gdy są one pompowane przez kolumnę małych kulek pod wysokim ciśnieniem. Różne peptydy eluują w różnych punktach czasowych i są wykrywane przez monitor, często spektrofotometr UV.
Podczas przeprowadzania badań nad peptydami często substancja będąca przedmiotem zainteresowania jest rzadka i nie można jej kupić od firm chemicznych. Jeśli znana jest struktura pożądanego peptydu, często łatwiej jest go przygotować chemicznie przez syntezę peptydu niż izolować związek ze źródeł naturalnych. Izolacja produktów naturalnych jest niezwykle trudna. Peptydy syntetyczne są ogólnie oczyszczane za pomocą HPLC.
Taka synteza chemiczna może zniechęcać niezależnego badacza, który nie jest chemikiem. Często zadanie to zlecane jest firmom zajmującym się syntezą peptydów, które specjalizują się w tych technikach. Może to być bardziej ekonomiczne niż próba skonfigurowania systemu od zera w laboratorium. Firmy produkujące peptydy mogą wytwarzać niestandardowe peptydy dostosowane do potrzeb badacza.
Innym powodem oczyszczania peptydu może być sytuacja, gdy badacz oczyścił białko i próbuje ustalić jego tożsamość. On lub ona może rozkładać białko na fragmenty peptydowe, rozdzielać fragmenty przez oczyszczanie i mieć wzór fragmentacji peptydów wykrywany przez spektrometr masowy podczas eluowania z kolumny. Ta technika znana jest jako LC-MS, skrót od chromatografii cieczowej i spektrometrii mas. Daje masę cząsteczkową i skład aminokwasowy fragmentów i często umożliwia identyfikację białek, jeśli wcześniej zidentyfikowano podobne lub identyczne białka.
Wielu badaczy pracuje z peptydami o nowych cechach, takich jak nienaturalne aminokwasy, aby spróbować znaleźć te o nietypowej aktywności biologicznej. Istnieje cała dziedzina zwana peptydomimetykami poświęcona badaniu takich nowych peptydów. Często tworzone są sekwencje generowane komputerowo i syntetyzowana jest biblioteka peptydów obejmująca szereg nietypowych peptydów. Oczyszczanie peptydu stosuje się do oddzielenia poszczególnych członków tej biblioteki w celu zapewnienia czystego peptydu do testowania aktywności biologicznej. Ta strategia z powodzeniem wygenerowała co najmniej jeden nowy dostępny w handlu lek.
Wiele biologicznie aktywnych peptydów jest interesujących w zastosowaniach medycznych. Związki stosowane w handlu, takie jak insulina, są zwykle wytwarzane przez systemy nadekspresji rekombinowanego DNA, które wytwarzają duże ilości pożądanego związku. Często peptydy są modyfikowane genetycznie w celu ułatwienia oczyszczania poprzez dodanie do ich frontów jakiegoś znacznika. Pozwala to na zastosowanie chromatografii powinowactwa do oczyszczenia peptydu.
W przypadku tego typu chromatografii znacznik jest związkiem, takim jak histydyna, który wiąże matrycę kulek, np. Niklu, wybraną ze względu na jego zdolność do wiązania znacznika. Niepożądane białka i peptydy zwykle przechodzą przez kolumnę bez wiązania. Specjalnie zaprojektowany peptyd zwykle silnie wiąże się z kolumną. Po zmyciu zanieczyszczających białek i peptydów pożądany peptyd jest eluowany przez związek, który konkuruje o wiązanie z matrycą. Następnie otrzymuje się dość czysty preparat pożądanego peptydu, a znacznik można usunąć przez cięcie.