Co to jest opad białkowy?
Wytrącanie białka jest metodą stosowaną do ekstrakcji i oczyszczania białek przechowywanych w roztworze. Duże, złożone cząsteczki, białka ogólnie mają części, które mają ujemny ładunek elektryczny i części, które mają ładunek dodatni, a także części hydrofilowe i hydrofobowe. Istnieje tendencja białek w roztworze do zlepiania się i wytrącania z powodu przyciągania między ujemnie i dodatnio naładowanymi częściami cząsteczek oraz wzajemnego przyciągania części hydrofobowych. Przeciwdziałanie tej tendencji polega jednak na tym, że w roztworze wodnym cząsteczki wody, które są polarne, będą miały tendencję do rozmieszczania się wokół cząsteczek białka ze względu na przyciąganie elektrostatyczne między przeciwnie naładowanymi częściami wody i cząsteczek białka. Powoduje to, że cząsteczki białka są oddzielone i pozostają w roztworze, ale istnieją różne metody uzyskiwania precypitacji białek.
Najczęściej stosowaną metodą strącania białka jest dodanie roztworu soli, technika często określana jako „wysalanie”. Najczęściej stosowaną solą jest siarczan amonu. Interakcja jonów soli z cząsteczkami wody usuwa barierę wodną między cząsteczkami białka, umożliwiając kontakt hydrofobowych części białka. Powoduje to agregację cząsteczek białka i wytrącenie się z roztworu. Zasadniczo, im wyższa masa cząsteczkowa białka, tym niższe stężenie soli wymagane do spowodowania wytrącania, dlatego możliwe jest rozdzielenie mieszaniny różnych białek w roztworze poprzez stopniowe zwiększanie stężenia soli, tak aby różne białka wytrącają się na różnych etapach, proces znany jako wytrącanie częściowe.
Rozpuszczalność białka w środowisku wodnym można zmniejszyć przez wprowadzenie rozpuszczalnika organicznego. Powoduje to zmniejszenie stałej dielektrycznej, którą w tym kontekście można uznać za miarę polarności rozpuszczalnika. Zmniejszenie polarności oznacza, że cząsteczki rozpuszczalnika mają mniejszą tendencję do skupiania się wokół cząsteczek białka, tak że między cząsteczkami białka jest mniejsza bariera wodna, a większa tendencja do wytrącania białka. Wiele rozpuszczalników organicznych oddziałuje z hydrofobowymi częściami cząsteczek białka, powodując denaturację; jednak niektóre, takie jak etanol i dimetylosulfotlenek (DMSO), nie.
Chociaż białka mogą mieć części naładowane ujemnie i dodatnio, często w roztworze będą miały ogólny ładunek dodatni lub ujemny, który zmienia się w zależności od pH, i oddzielają je poprzez odpychanie elektrostatyczne. W warunkach kwaśnych, przy niskim pH, białka mają zwykle ogólny ładunek dodatni, podczas gdy w wysokim pH ładunek jest ujemny. Białka mają punkt pośredni, w którym nie ma ogólnego ładunku - jest to znane jako punkt izoelektryczny i dla większości białek leży w zakresie pH 4-6. Punkt izoelektryczny rozpuszczonego białka można osiągnąć przez dodanie kwasu, zwykle kwasu chlorowodorowego lub siarkowego, w celu obniżenia pH do odpowiedniego poziomu, umożliwiając tworzenie skupisk i wytrącanie cząsteczek białka. Wadą tego sposobu jest to, że kwasy mają tendencję do denaturacji białka, ale często stosuje się je do usuwania niepożądanych białek.
Inne metody precypitacji białek obejmują niejonowe hydrofilowe polimery i jony metali. Te pierwsze zmniejszają ilość dostępnej wody, tworząc barierę między cząsteczkami białka, umożliwiając im zlepianie się i wytrącanie. Dodatnio naładowane jony metali mogą wiązać się z ujemnie naładowanymi częściami cząsteczki białka, zmniejszając tendencję białka do przyciągania warstwy cząsteczek wody wokół niego, ponownie umożliwiając cząsteczkom białka wzajemne oddziaływanie i wytrącanie się z roztworu. Jony metali są skuteczne nawet w bardzo rozcieńczonych roztworach.