Что такое секвенирование дробовика?

Секвенирование с помощью дробовика - это метод секвенирования ДНК, при котором длинный участок ДНК физически разбивается на маленькие (приблизительно 2000 пар оснований) фрагменты, которые клонируются, секвенируются и собираются с использованием компьютерного анализа. Он был разработан и известен Крейгом Вентером из корпорации Celera. Вентер разработал эту технику в 1996 году, работая в Институте исследований генома.

Вентер основал Celera в 1998 году с целью секвенирования генома человека в течение трех лет. Эта цель была в прямой конкуренции с уже действующим проектом «Геном человека», консорциумом университетов, работающих вместе для секвенирования генома человека, используя более старую стратегию, называемую секвенированием на основе карт или BAC-BAC. Этот метод включал сначала разбиение генома на 150000 частей пары оснований, называемых ВАС, сборку ВАС по порядку, а затем детальное секвенирование каждого ВАС.

Секвенирование дробовика всего генома обходит создание и картирование BACs и начинается прямо с секвенирования ДНК. Процесс начинается с получения образца ДНК с высокой молекулярной массой из представляющего интерес организма и его физического дробления на мелкие кусочки путем пропускания через узкий шприц или обработки ультразвуком - способа разрушения образца с использованием звуковых волн. Срез - это случайный процесс, поэтому последовательности фрагментов будут частично перекрываться. Срезание не создает конкретно 2000 фрагментов пары оснований, необходимых для секвенирования, скорее, фрагменты желаемого размера должны быть очищены от смеси.

Следующим шагом является объединение фрагментов ДНК с ДНК-носителем, называемым вектором. Этот процесс известен как клонирование, и он создает библиотеку секвенирования, из которой будет создана последовательность всего генома. Последовательность каждого клона в библиотеке определяется, и компьютерный анализ используется для поиска перекрывающихся или непрерывных последовательностей в каждом фрагменте. Сборка перекрытий создает «контиг», который представляет собой длинный непрерывный участок последовательности ДНК.

Клонирование дробовика обычно приводит к некоторым промежуткам между контигами, потому что некоторые последовательности случайно отсутствуют в библиотеке. Пробелы могут быть заполнены созданием новой библиотеки или использованием известных последовательностей для расширения наружу от контига. Поскольку последовательность секвенирования дробовика ДНК фрагментов случайным образом, многие фрагменты секвенируются более одного раза, создавая большую уверенность в правильности последовательности, чем если бы каждый фрагмент был секвенирован только один или два раза.

Геном человека был секвенирован как в рамках проекта «Геном человека» с использованием секвенирования на основе карт, так и с помощью Celera с использованием секвенирования с помощью дробовика. Секвенирование дробовика в настоящее время является предпочтительным методом для других видов секвенирования генома. Таким образом были секвенированы полные геномы многих организмов, таких как растение Arabidopsis thaliana , рис, корова, собака, курица, шимпанзе, крыса, мышь, толстолобик и многие микроорганизмы.