Как определяется уровень фосфорилирования?

Уровень фосфорилирования органических молекул или веществ определяют двумя методами: вестерн-блоттинг и масс-спектрометрия. Фосфорилирование чаще всего относится к прикреплению фосфата к белку. Когда фосфаты прикрепляются к протоенам, нарушаются естественные процессы и функции белковых ферментов в организме человека. Определение уровня фосфорилирования имеет решающее значение для лечения широкого спектра заболеваний, от рака до диабета.

Вестерн-блоттинг является популярным методом, используемым для определения уровня фосфорилирования определенного набора белков. Антитела, такие как анти-фосфотирозиновые моноклональные антитела, обычно используются, потому что они легко связываются с остатками тирозина в белке, на которые влияет фосфорилирование. При вестерн-блоттинге белки сначала разделяются по размеру с использованием метода электрического заряда, известного как гель-электрофорез.

Затем белки переносятся на мембрану, которая покрыта специальными антителами, которые связываются с фосфатами белков. Как только белки перенесены, антитела будут прилипать к любым белкам с прикрепленным фосфатом. Уровень фосфорилирования затем может быть определен с помощью рентгеновского исследования мембраны. Любые затронутые белки испускают вспышку света, облегчая для исследователя измерение уровней фосфорилирования.

Масс-спектрометрия является еще одним способом измерения уровня фосфорилирования вещества. Этот процесс преобразует молекулы белка в ионы, что облегчает их отслеживание и измерение. Образец ионизируется мощным источником ионов, который наполняет образец электронами. Это действие превращает образец в катионы, положительно заряженные ионы.

Масс-анализатор масс-спектрометра разделяет ионы по их массе и интенсивности заряда. Это позволяет исследователю определить отношение массы к заряду, что имеет решающее значение для определения уровня фосфорилирования образца. Наконец, детектор измеряет ионы в порядке, так что данные могут быть отображены в виде диаграммы. Диаграмма показывает отношение массы к заряду ионов на оси x и относительную интенсивность ионов на оси y.

Уровни фосфорилирования также можно измерять во время фосфорилирования субстрата. Фосфорилирование субстрата представляет собой процесс, который создает аденозинтрифосфат (АТФ), молекулу, критическую для передачи энергии между клетками, во время гликолиза. Этот процесс происходит как в клетках животных, так и в растительных клетках.

В растительных клетках молекулы АТФ создаются с использованием солнечной энергии. Эта энергия стимулирует фосфорилирование в хлоропластах растений, месте фотосинтеза растений. Уровень фосфорилирования коррелирует с количеством фосфата, необходимого для создания дополнительных молекул АТФ.