Что такое изоэлектрическая точка?

Белки состоят из цепочек аминокислот, каждая из которых имеет разные значения рН. Общий pH белка состоит из смеси значений pH отдельных аминокислот, поскольку они образуют ионы в конкретном растворе, в котором они растворены. Изоэлектрическая точка (pI) белка - это pH, при котором этот белок не имеет чистого заряда. Это свойство может быть использовано для отделения белка с известным pI от других белков в гетерогенной смеси.

Аминокислоты имеют аминоконцевую группу, которая является основной, имеющей высокий рН. Другим концом аминокислоты является карбоксильный конец, который является кислым, с низким pH. При разных значениях pH аминокислоты на белках будут различаться по своему заряду. Белки ниже их изоэлектрической точки имеют положительный заряд. Напротив, те, кто выше этой точки, имеют отрицательный заряд.

Чтобы использовать знание изоэлектрической точки для очистки белка, смесь белков подвергается воздействию электрического поля. Обычно это делается в агарозных или полиакриламидных гелях и называется изоэлектрическим фокусированием. Более старая методика заключается в выполнении процедуры в большем масштабе в стеклянной колонке с использованием раствора сахарозы с электродами на каждом конце. Добавляются соединения, называемые амфолитами, которые вызывают образование постоянного градиента рН. Когда гель или колонка подвергаются воздействию электрического тока, белки мигрируют, пока не достигнут своей изоэлектрической точки, а затем остаются неподвижными.

Белки на гелях обычно делаются видимыми благодаря красителю, который связывает белки. Иногда, если ферменты изучаются, можно использовать субстрат, который дает цветную реакцию. Обычно используются стандарты, содержащие белки известных изоэлектрических точек.

Как только кто-то знает, где находится желаемый белок, общепринятым методом является вырезание выделенного белка из геля. Затем белок может быть очищен и секвенирован. Как только последовательность известна, ее можно использовать для конструирования праймеров для полимеразной цепной реакции (pcr) и использовать для клонирования гена белка, если доступен подходящий материал нуклеиновой кислоты.

Изоэлектрическое фокусирование также является распространенным способом анализа тесно связанных белков, чтобы увидеть, насколько они отличаются друг от друга. Одним из осложнений может быть то, что белки могут иметь связанные с ними сахара. Это называется гликозилированием и может влиять на pI белка. Может показаться, что существует несколько белков с разными изоэлектрическими точками, хотя на самом деле существует только один белок, который дифференцированно гликозилирован. Белки, очищенные стандартными методами, такими как хроматография, иногда анализируют с помощью изоэлектрического фокусирования для обеспечения их чистоты.