Hur fastställs fosforyleringsnivån?

Fosforyleringsnivån för organiska molekyler eller substanser bestäms med två metoder: western blotting och masspektrometri. Fosforylering avser ofta fästningen av ett fosfat till protein. När fosfater kopplas till protiens störs de naturliga processerna och funktionerna hos proteinenzymer i människokroppen. Att bestämma fosforyleringsnivån är avgörande för att behandla ett brett spektrum av sjukdomar, från cancer till diabetes.

Western blotting är en populär metod som används för att bestämma fosforyleringsnivån för en viss uppsättning proteiner. Antikroppar, såsom monoklonala antikroppar mot fosfo-tyrosin, används vanligtvis eftersom de lätt binder till ett proteins tyrosinrester, som påverkas av fosforylering. I western blotting separeras proteinerna först efter storlek med användning av en elektrisk laddningsmetod känd som gelelektrofores.

Proteinerna överförs sedan till ett membran som har täckts med speciella antikroppar som binder till fosfater på proteiner. När proteinerna har överförts kommer antikropparna att hålla sig till eventuella proteiner med ett bifogat fosfat. Fosforyleringsnivån kan sedan bestämmas med en röntgenstråle av membranet. Eventuella påverkade proteiner avger en ljusglimt, vilket gör det lättare för forskaren att mäta fosforyleringsnivåer.

Masspektrometri är ett annat sätt att mäta fosforyleringsnivån för ett ämne. Denna process omvandlar proteinmolekylerna till joner, vilket gör dem lättare att spåra och mäta. Provet joniseras av en högdriven jonkälla som översvämmer provet med elektroner. Denna åtgärd förvandlar provet till katjoner, positivt laddade joner.

Massanalysatorn för masspektrometern separerar jonerna med deras massa och laddningsintensitet. Detta gör det möjligt för forskaren att upptäcka mass-till-laddningsförhållandet, vilket är avgörande för att upptäcka fosforyleringsnivån för provet. Slutligen mäter detektorn jonerna i ordning så att data kan visas i kartform. Diagrammet visar massan-till-laddningsförhållandet för jonerna på x-axeln och den relativa intensiteten för jonerna på y-axeln.

Fosforyleringsnivåer kan också mätas under substratfosforylering. Substratfosforylering är en process som skapar adenosintrifosfat (ATP), en molekyl som är kritisk för energiöverföring mellan celler under glykolys. Denna process sker i både djurceller och växtceller.

I växtceller skapas ATP-molekyler genom att använda energi från solen. Denna energi stimulerar fosforylering i växtens kloroplaster, platsen för växtens fotosyntes. Fosforyleringsnivån korrelerar med mängden fosfat som krävs för att skapa ytterligare ATP-molekyler.