Vad är en rekombinant plasmid?
En plasmid är en cirkulär bit DNA som finns i många bakterier. Den mest anmärkningsvärda egenskapen hos plasmider är att de replikerar oberoende av värdens huvudsakliga DNA. Ofta används en plasmid i rekombinant kloningsteknik för att klona nyligen isolerade gener. Det är också mycket vanligt att använda en rekombinant plasmid för att uttrycka stora mängder av en känd gen för att erhålla RNA eller protein från den. Sådant rekombinant genuttryck har varit oumbärligt för bioteknikindustrin.
Rekombinanta plasmider utvecklades först i labrotten i bakterievärlden, Escherichia coli . Många andra typer av bakterier kan innehålla sådana plasmider. Dessa bitar av självreplikerande DNA kan överföras naturligt mellan olika typer av bakterier. Trots detta var det ibland svårt att införa de rekombinanta plasmiderna i andra typer av bakterier.
Det primära förfarandet för att införa DNA i andra celler kallas transformation, där bakterierna behandlas med kemikalier som gör dem mer benägna att ta upp främmande DNA. En annan teknik innebär att chocka bakterierna med en elektrisk ström. Detta kallas elektroporation.
Skälen för att skapa en rekombinant plasmid varierar. Ofta när DNA först isoleras från en viss vävnad eller organism omvandlas det till plasmider för att skapa ett bibliotek. Då kan DNA extraheras från enskilda kolonier. Därefter kan de screenas genom DNA-sekvensering för att bestämma vilka typer av gener som finns när sekvenserna finns i en databas. Ibland klonas gener med okända funktioner.
I andra fall är genprodukten välkänd, men forskarna vill uttrycka stora mängder av den för ytterligare studier. Genen kan klonas till rekombinanta plasmider som är överuttrycksvektorer. De är särskilt utformade för att producera stora mängder RNA eller protein. Detta har varit särskilt värdefullt för rekombinanta humana proteiner, som tidigare ofta endast var tillgängliga från kadavrar, vilket gjorde det mycket svårt att studera funktionen hos en viss gen.
Flera faktorer är involverade i konstruktion av en plasmid som kan användas vid molekylär kloning. Plasmiden måste ha en valbar markör. Detta gör det möjligt att välja en cell med genen. Normalt utöver antalet celler som saknar genen med markören mycket högre än mängden celler som bär den. I allmänhet har en rekombinant plasmid resistens mot ett antibiotikum eller kan växa i frånvaro av en speciell aminosyra.
En sådan plasmid behöver ett ursprung för replikation så att den kan börja syntetisera dess rekombinanta DNA. Dessutom kräver en rekombinant plasmid en uppsättning speciella sekvenser för att tillåta ett restriktionsenzym att klyva DNA för att tillåta en gen att infogas i kloningsvektorn. Det finns ett stort antal restriktionsenzymer som är mycket specialiserade för specifika DNA-sekvenser som måste finnas när genen börjar och slutar.
Traditionella bakteriestammar har använts för DNA-kloning i årtionden. Dessutom finns det nya kit som använder speciellt konstruerade bakteriestammar för att underlätta överuttryck av genprodukten. De kombinerar tekniken för kloning av en gen med en metod som möjliggör enkel rening av proteinet uttryckt från genen när det har klonats in i den rekombinanta plasmiden.