กล้องจุลทรรศน์ confocal เป็นกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์ชนิดพิเศษที่ใช้ในการรับภาพ 2D และ 3D คุณภาพสูง ด้วยกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์ (สนามกว้าง) แสงของความยาวคลื่นหนึ่ง ๆ จะถูกส่องบนชิ้นงานและชิ้นงานจะดูดซับแสงบางส่วนและสะท้อนส่วนที่เหลือที่ความยาวคลื่นนานขึ้น แสงความยาวคลื่นที่ยาวกว่าจะผ่านกระจกดิจิโรอิคซึ่งจะช่วยให้แสงความยาวคลื่นที่ยาวขึ้น แต่ไม่ใช่แสงความยาวคลื่นที่สั้นกว่า บุคคลที่ดูตัวอย่างจะเห็นเฉพาะแสงที่ผ่านกระจกดิจิโรอิคเท่านั้น กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์ขั้นพื้นฐานจะจับแสงทั้งในโฟกัสและไม่อยู่ในโฟกัสซึ่งทำงานได้ดีสำหรับตัวอย่างขนาดใหญ่ที่ไม่ต้องการความละเอียดสูงมาก มันใช้งานไม่ได้ดีสำหรับการดูรายละเอียดที่ดี ต้องใช้กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลเพื่อจับภาพความละเอียดสูง
กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลใช้รูเข็มเพื่อปฏิเสธแสงโฟกัส แทนที่จะเป็นแสงที่ส่องผ่านกระจกดิจิโรอิคเท่านั้นแสงจะถูกส่องผ่านทั้งกระจกดิจิโรอิคและรูเข็มซึ่งหมายความว่าผู้ที่ดูตัวอย่างจะเห็นเพียงจุดเดียวของตัวอย่าง เพื่อที่จะดูตัวอย่างทั้งหมดกระจกที่สามารถเคลื่อนย้ายจะสแกนแสงผ่านระนาบสี่เหลี่ยมของตัวอย่างและคอมพิวเตอร์จะรวบรวมแสงที่ปล่อยออกมาเมื่อชิ้นงานถูกสแกน การสแกนแบบสมบูรณ์จะส่งผลให้ชิ้นงานแสงหรือชิ้นงานตัดขวางของชิ้นงานทดสอบ กล้องจุลทรรศน์ชนิดนี้เรียกว่ากล้องจุลทรรศน์สแกนแบบคอนโฟคอลเลเซอร์ส่วนหนึ่งเป็นเพราะเลเซอร์ถูกใช้เป็นแหล่งกำเนิดแสง
ในการสร้างภาพ 3 มิติจะทำการสแกนหลายครั้งสร้าง "ชิ้นงาน" หลายชิ้นจากนั้นคอมพิวเตอร์จะรวมแต่ละชิ้นเพื่อสร้างภาพสามมิติ กล้องจุลทรรศน์สามารถตั้งโปรแกรมให้เปลี่ยนช่องว่างระหว่างสไลซ์ได้ขึ้นอยู่กับว่าภาพ 3 มิติที่ผู้ใช้ต้องการได้รับที่คมชัดเพียงใด กล้องจุลทรรศน์ยังสามารถเปลี่ยนแปลงความเร็วในการสแกนภาพด้วยการสแกนช้าให้ความละเอียดสูงกว่าการสแกนที่รวดเร็ว
กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลกลายเป็นอุปกรณ์ที่ใช้กันอย่างแพร่หลายในห้องปฏิบัติการวิทยาศาสตร์ชีวภาพหลายแห่ง พวกเขามีราคาแพงและค่อนข้างใหญ่และมักจะมีห้องที่ทุ่มเทให้กับการใช้งานของพวกเขาเพราะห้องจะต้องมืดเพื่อให้ได้ภาพเรืองแสงที่ดี แม้ว่ากล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลมักใช้ในการดูเซลล์และโครงสร้างภายในเซลล์ แต่ก็สามารถใช้เพื่อให้ได้ภาพของตัวอย่างฟลูออเรสเซนต์สามมิติและบางครั้งใช้เพื่อดูวัสดุสารกึ่งตัวนำ
