Yüzlerce farklı protein konsantrasyon tayini yöntemi vardır. Biyokimyacıların analiz ettiği protein solüsyonları türündeki inanılmaz çeşitlilik, her türlü protein solüsyonu için işe yarayan tek bir evrensel yöntemin bulunmamasının nedenidir. En yaygın protein analizleri Bradford analizi, Lowry analizi ve bisikoninik asit analizidir. Bununla birlikte, protein çözeltisi ile tahlilde kullanılan reaktifler arasındaki olası kimyasal uyumsuzluklar etrafında çalışmak için ihtiyaç duyulan çok sayıda değişiklik geliştirilmiştir.
Genel olarak konuşursak, protein konsantrasyonunun belirlenmesi için iki ana analiz kategorisi vardır. Birinci yöntem grubunda, bir protein çözeltisine renkli veya flüoresan bir boya eklenir ve spesifik olarak proteine bağlanır. Bağlı boya, protein miktarıyla orantılı olan benzersiz bir emme dalga boyuna sahiptir. Bir spektrometre kullanarak, protein konsantrasyonunu tahmin etmek mümkün hale gelir.
İkinci test grubu, bu iyonların bakır (I) iyonlarına indirgendiği bir protein çözeltisine bakır (II) iyonlarının eklenmesini içerir. Bu indirgenmiş iyonlar daha sonra proteinlere bağlanarak renkli kompleksler oluşturabilir. Absorbansları benzersiz dalga boylarında ölçerek, protein konsantrasyonları da benzer şekilde çıkarılabilir.
En popüler protein konsantrasyon tayin yöntemlerinden biri Bradford tahlilidir. Bu tahlilde, asidik koşullar altında bir protein çözeltisine, koomasi parlak mavi denilen kırmızı bir boya ilave edilir. Bu boya proteine bağlandığından, 595 nanometrede karakteristik emiciliği olan kalıcı mavi bir kompleks oluşturur.
Bradford tahlilinin genel çok yönlülüğüne rağmen, bazı protein solüsyonlarıyla uyumlu değildir. Özellikle, Bradford tahlili, proteinleri saflaştırmak ve hücreleri lizizle parçalamak için yaygın olarak kullanılan bir deterjan olan sodyum dodesil sülfat (SDS) mevcudiyeti ile bozulur. Bu deterjan, boyanın proteinlere bağlanmasını engeller, bu da güvenilir olmayan ve yanlış bir emilim okuması ile sonuçlanır. SDS mevcut olduğunda, diğer yöntem türleri kullanılmalıdır.
Başka bir protein tahlili dizisi geliştirilmiştir ve hepsi Biuret testinin bir çeşitlemesini içerir. Bu reaksiyonda, bir protein sulu bir baz ve bakır (II) iyonları ile birleştirilir. Bu iyonlar azalır ve daha sonra renkli kompleksler oluşturmak için protein ile şelatlanır. Bu testi kullanan iki deney, Lowry testi ve bisikoninik asit analizidir.
Lowry testiyle, Biuret testine bir Folin-Ciocalteu reaktifi eklenir. Folin-Ciocalteu reaktifi aromatik kalıntıları, özellikle triptofanı okside eder ve kompleksin 750 nanometrede güçlü bir şekilde emilmesine yardımcı olur. Bisikoninik asit tahlili, diğer taraftan, Biuret testine bisikoninik asit eklenmesini içerir. Yaklaşık 104 ° Fahrenheit'te (40 ° Santigrat) kısa bir inkübasyondan sonra, iki eşdeğer asit ve proteinin peptid bağları tek bir bakır (I) iyonunu şelatlar. Sonuç 562 nanometrede güçlü bir şekilde emen bir komplekstir.
Protein konsantrasyonunun belirlenmesi için bir yöntem seçerken, birinin çözeltide mevcut olan farklı kimyasal fonksiyonel grupları göz önünde bulundurması önemlidir. Bazı amino asit yan zincirlerinin, disülfit bağlarının ve kofaktörlerin varlığı, protein konsantrasyonunun belirlenmesini çılgınca yanlış yapabilir. Sadece proteinleri değil aynı zamanda indirgeyici ajanlar ve deterjanlar gibi diğer reaktifleri ve tamponları da göz önünde bulundurmak çoğu zaman gereklidir. İdeal yöntem kimyasal olarak uyumlu, aynı zamanda güvenilir, ucuz ve kurulumu basit olacaktır.
