Co je to oligonukleotid?
Oligonukleotid je krátký řetězec molekul DNA nebo RNA, který má mnoho využití v molekulární biologii a medicíně. Používá se jako sonda k testování nemocí, virových infekcí a k identifikaci genů v experimentech molekulární biologie. Používá se také jako primer při sekvenování typu DNA.
K porozumění oligonukleotidu pomáhá porozumět struktuře DNA. DNA molekuly jsou velmi dlouhé cívky dvou řetězců, vyrobené ze čtyř různých nukleotidových základních jednotek, uspořádaných v různých řádech. Každá jednotka má komplementární bázi, na kterou se váže, takže každý řetězec má opačnou sadu bází, které ji váží. Tyto báze mohou tvořit velké množství různých kombinací a je to kombinace bází, která dává genetický kód. DNA se přepisuje za účelem produkce messengerové RNA (mRNA), která se pak překládá za vzniku proteinů.
Oligonukleotidy jsou identifikovány podle délky jejich řetězce. Například oligonukleotid, který je deset nukleotidových bází dlouhý, by se nazýval deset mer . Obvykle jsou syntetizovány chemicky a typ syntézy omezuje délku řetězce na méně než 60 bází.
V typu DNA sekvenování známém jako dideoxy sekvenování se oligonukleotidy používají jako primer, takže enzym, který DNA vytváří, bude mít šablonu, ze které bude fungovat. Použije se jednořetězcová DNA a oligonukleotid, který je komplementární k řetězci DNA, se syntetizuje pomocí automatizovaného stroje. DNA polymeráza, která syntetizuje DNA, pokračuje v přidávání na primer a syntetizuje z ní opačný řetězec DNA. Tato reakce produkuje dvouvláknovou DNA.
Novější použití oligonukleotidů jako primerů je v polymerázové řetězové reakci (PCR), která se používá k amplifikaci malých fragmentů DNA. Tato technika má velmi praktická použití, například ve forenzním testování a testování otcovství. Rovněž revolucionizoval výzkum v medicíně a biologických vědách, protože se často používá v experimentech genetického inženýrství.
K izolaci genů z knihovny genů nebo komplementárních DNA (cDNA) se často používá řada oligonukleotidových sond. Knihovny cDNA sestávají z dvouvláknové DNA, ve které je jedno vlákno odvozeno od vlákna mRNA a druhé je komplementární. Takové knihovny mají výhodu v tom, že nemají mezery, které se často vyskytují v genech z vyšších organismů.
Struktura genů z mnoha organismů je známa díky sekvenčním projektům a je veřejně dostupná. Pokud někdo chce klonovat gen z jiného organismu, může vidět, co je o genu známo v jiných organismech, a navrhnout sondy založené na společných oblastech v těchto sekvencích. Vědci pak mají syntetizovanou řadu oligonukleotidových sond, které berou v úvahu možné variace ve společné oblasti. Skrínují knihovnu těmito sondami a hledají oligonukleotidy, které se vážou. Tímto způsobem bylo identifikováno mnoho genů.
Antisense oligonukleotid obsahuje jedno vlákno RNA nebo DNA, které je doplňkem sledované sekvence. Jakmile byl klonován konkrétní gen kódující protein, je antisense RNA často používána k blokování její exprese vazbou na mRNA, která by ji syntetizovala. To umožňuje vědcům určit účinky na organismus, když tento protein neprodukuje. Antisense oligonukleotidy se vyvíjejí také jako nové typy léčiv pro blokování toxických RNA.
Čipy microarray byly další oblastí, ve které byly oligonukleotidy velmi užitečné. Jsou to sklíčka nebo jiná matrice, které mají skvrny obsahující tisíce různých DNA sond - v tomto případě vyrobených z oligonukleotidů. Jsou to velmi účinný způsob, jak testovat změny v řadě různých genů najednou. DNA se váže na sloučeninu, která mění barvu nebo fluoreskuje, pokud se na ni komplementární DNA váže, takže skvrny změní barvu, pokud dojde k reakci s testovanou DNA.
Některé z věcí, které se používají pro oligonukleotidové mikročipy, zahrnují screening genetických chorob. Například existují malé sondy, které představují aktivitu genů zapojených do rakoviny prsu, BRCA1 a BRCA2 . Je možné zjistit, zda žena má mutaci v jednom z těchto genů, a dále ji analyzovat, aby zjistila, zda má predispozici k rakovině prsu.
Existuje mikročip nazvaný ViroChip, který má sondy pro asi 20 000 genů z různých patogenních virů, které byly sekvenovány. Sekvence těla, jako je hlen, lze analyzovat pomocí čipu, který může často identifikovat, jaký typ viru je člověk infikován. Identifikace virových infekcí může být docela obtížná, protože příznaky jsou často podobné u různých typů virů.