Co to jest biblioteka genowa?
Biblioteka genów to termin określający kolekcje fragmentów kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA), które zostały sklonowane losowo z genomów organizmów. Są klonowane jako plazmidy, które mogą replikować się oddzielnie od swoich chromosomów i fagów, które są pasożytniczymi wirusami żywiącymi się bakteriami. Po sklonowaniu jako plazmidy kolekcja składa się z komórek gospodarza, a każda z komórek zawiera fragment DNA. Biblioteki genów fagów składają się z tak zwanych lizatów fagów, które są resztkami zniszczonych komórek z wstawionym fragmentem DNA. Kiedy biblioteki genów zawierają zbiór wszystkich informacji genetycznych o organizmie, są one uważane za reprezentatywną bibliotekę genów.
Dodatkowo biblioteki mogą wykorzystywać komórkowy rekombinowany kwas nukleinowy (RNA) do cumowania materiału, a ten zbiór komórek gospodarza z rekombinowanymi wektorami jest znany jako biblioteka genów cRNA. Przeszukiwanie biblioteki genów znajduje określone komórki zawierające wektory do klonowania, a konkretnego genu poszukiwanego w bibliotece genów, a następnie wykorzystuje jedną z wielu technik ich izolacji i zbierania. Po zebraniu komórki uważa się za sklonowane. Aby mieć uzasadnioną szansę na izolację i klonowanie konkretnego genu, zwykle używa się tylko reprezentatywnych bibliotek genów, ponieważ każdy gen i każdy oryginalny fragment DNA określonego genomu jest w nim gromadzony. Aby osiągnąć 99% szansy na zlokalizowanie konkretnego ludzkiego genu do klonowania, ponad 600 000 sklonowanych komórek musiałoby zostać przebadanych w celu znalezienia pożądanego genu z reprezentatywnej biblioteki genów.
DNA jest ekstrahowane z organizmu, aby uruchomić bibliotekę genów. Biblioteka ma strukturę umożliwiającą uporządkowanie DNA i tysięcy różnych genów. Biblioteka staje się zbiorem dziesiątek tysięcy kolonii bakteryjnych, z których każda modulowana jest fragmentem DNA z organizmu, który zawiera gen o szczególnym znaczeniu. Biblioteki zawierają również enzymy restrykcyjne i plazmid. Enzymy restrykcyjne są używane do odczytu informacji nukleotydowej DNA i są wykorzystywane do cięcia DNA na fragmenty poprzez oddzielenie nukleotydów od siebie.
Te same enzymy restrykcyjne przecinają bakteryjne plazmidy, a fragmenty i plazmidy są łączone w probówce w celu połączenia, tworząc nową kombinację. Te rekombinowane plazmidy są następnie przywracane z powrotem do hodowli bakterii przy użyciu szoku cieplnego lub elektroporacji. Kroki te są wykonywane w kółko, aż do utworzenia całej biblioteki genów dla określonego organizmu genomu ze wszystkich fragmentów oryginalnej ekstrakcji DNA.