Co je genová knihovna?
Genová knihovna je termín pro sbírky fragmentů kyseliny deoxyribonukleové (DNA), které byly náhodně klonovány z genomů organismů. Klonují se jako plazmidy, které se mohou replikovat odděleně od svých chromozomů a fágů, což je parazitární virus, který se živí bakteriemi. Když je klonován jako plasmidy, je kolekce hostitelských buněk a každá z buněk obsahuje fragment DNA. Knihovny fágových genů jsou tvořeny tzv. Fágovými lyzáty, což jsou zbytky zničených buněk s vloženým fragmentem DNA. Pokud genové knihovny obsahují soubor všech genetických informací o organismu, považují se za reprezentativní genovou knihovnu.
Knihovny mohou dále použít buněčný rekombinantní nukleovou kyselinu (RNA) pro materiál pro ukotvení a tato kolekce hostitelských buněk s rekombinantními vektory je známá jako genová knihovna cRNA. Screening genové knihovny vyhledá konkrétní buňky obsahující klonovací vektory s konkrétním genem hledaným v genové knihovně a poté použije jednu z mnoha technik jejich izolace a sklizení. Po sklizni se buňky považují za klonované. Za účelem získání přiměřené šance na izolaci a klonování konkrétního genu se obvykle používají pouze reprezentativní knihovny genů, protože každý gen se shromažďuje každý původní fragment DNA konkrétního genomu. K dosažení 99% šance na lokalizaci konkrétního lidského genu pro klonování by bylo nutné skrínovat více než 600 000 klonovaných buněk, aby se našel požadovaný gen z reprezentativní genové knihovny.
DNA je extrahována z organismu pro zahájení genové knihovny. Knihovna je strukturována tak, aby organizovala DNA a její tisíce různých genů. Knihovna se stává sbírkou desítek tisíc bakteriálních kolonií, z nichž každá je modulována fragmentem DNA z organismu, který obsahuje gen zvláštního zájmu. Knihovny také obsahují restrikční enzymy a plasmid. Restrikční enzymy se používají ke čtení nukleotidových informací o DNA a používají se k rozštěpení DNA na fragmenty oddělením nukleotidů od sebe navzájem.
Stejné restrikční enzymy rozštěpily bakteriální plazmidy a fragmenty a plazmidy se spojily do zkumavky, aby se spojily, čímž se vytvoří nová kombinace. Tyto rekombinantní plazmidy jsou pak vráceny zpět do bakteriální kultury pomocí tepelného šoku nebo elektroporace. Tyto kroky se provádějí znovu a znovu, dokud se nevytvoří celá genová knihovna pro konkrétní genomový organismus ze všech fragmentů původní extrakce DNA.