Wat is eiwitneerslag?
Eiwitneerslag is een methode die wordt gebruikt om in een oplossing gehouden eiwitten te extraheren en te zuiveren. Grote, complexe moleculen, eiwitten hebben over het algemeen delen die een negatieve elektrische lading hebben en delen die een positieve lading hebben, evenals hydrofiele en hydrofobe delen. Er is een neiging voor eiwitten in oplossing om samen te klonteren en neer te slaan vanwege de aantrekking tussen de negatief en positief geladen delen van de moleculen en de wederzijdse aantrekking van de hydrofobe delen. Het tegengaan van deze neiging is echter het feit dat in een waterige oplossing watermoleculen, die polair zijn, de neiging zullen hebben zich rond de eiwitmoleculen te schikken vanwege de elektrostatische aantrekking tussen tegengesteld geladen delen van het water en eiwitmoleculen. Dit resulteert erin dat de eiwitmoleculen uit elkaar worden gehouden en in oplossing blijven, maar er zijn verschillende methoden om neerslag van eiwitten te bereiken.
De meest gebruikte methode voor eiwitprecipitatie is door een oplossing van een zout toe te voegen, een techniek die vaak wordt aangeduid als "uitzouten". Het meest gebruikte zout is ammoniumsulfaat. De interactie van de zoutionen met watermoleculen verwijdert de waterbarrière tussen eiwitmoleculen, waardoor de hydrofobe delen van het eiwit in contact kunnen komen. Dit resulteert erin dat de eiwitmoleculen samenkomen en uit de oplossing neerslaan. Als algemene regel geldt: hoe hoger het molecuulgewicht van het eiwit, hoe lager de concentratie van het zout dat nodig is om neerslag te veroorzaken, dus het is mogelijk om een mengsel van verschillende eiwitten in oplossing te scheiden door de zoutconcentratie geleidelijk te verhogen, zodat verschillende eiwitten neerslaan in verschillende stadia, een proces dat bekend staat als fractionele neerslag.
De oplosbaarheid van een eiwit in een waterig medium kan worden verminderd door een organisch oplosmiddel in te brengen. Dit heeft het effect van het verminderen van de diëlektrische constante, die in deze context kan worden beschouwd als een maat voor de polariteit van een oplosmiddel. Een vermindering van polariteit betekent dat oplosmiddelmoleculen minder de neiging hebben om rond die van het eiwit te clusteren, zodat er minder een waterbarrière tussen eiwitmoleculen is en een grotere neiging tot eiwitneerslag. Veel organische oplosmiddelen werken in op de hydrofobe delen van eiwitmoleculen en veroorzaken denaturisatie; sommige, zoals ethanol en dimethylsulfoxide (DMSO), doen dit echter niet.
Hoewel eiwitten negatief en positief geladen delen kunnen hebben, zullen ze in oplossing vaak een algehele positieve of negatieve lading hebben die varieert volgens de pH en ze gescheiden houden door elektrostatische afstoting. In zure omstandigheden, met een lage pH, hebben eiwitten de neiging om een algemene positieve lading te hebben, terwijl bij hoge pH de lading negatief is. Eiwitten hebben een tussenliggend punt waarop er geen algehele lading is - dit staat bekend als het isoelektrische punt en voor de meeste eiwitten ligt het in het pH-bereik 4-6. Het isoelektrische punt voor een opgelost eiwit kan worden bereikt door toevoeging van een zuur, meestal zoutzuur of zwavelzuur, om de pH tot het juiste niveau te verlagen, waardoor clustering en neerslag van de eiwitmoleculen mogelijk wordt. Een nadeel van deze methode is dat de zuren de neiging hebben het eiwit te denatureren, maar het wordt vaak gebruikt om ongewenste eiwitten te verwijderen.
Andere methoden van eiwitprecipitatie omvatten niet-ionische hydrofiele polymeren en metaalionen. De eerste vermindert de beschikbare hoeveelheid water om een barrière tussen eiwitmoleculen te vormen, waardoor ze samen kunnen klonteren en neerslaan. Positief geladen metaalionen kunnen binden met negatief geladen delen van het eiwitmolecuul, waardoor de neiging van het eiwit om een laag watermoleculen eromheen aan te trekken wordt verminderd, waardoor de eiwitmoleculen weer met elkaar kunnen interageren en uit de oplossing neerslaan. Metaalionen zijn effectief, zelfs in zeer verdunde oplossingen.