Was ist Proteinfällung?
Die Proteinfällung ist eine Methode zur Extraktion und Reinigung von Proteinen in einer Lösung. Große, komplexe Moleküle, Proteine haben im Allgemeinen Teile, die eine negative elektrische Ladung haben, und Teile, die eine positive Ladung haben, sowie hydrophile und hydrophobe Teile. In Lösung befindliche Proteine neigen aufgrund der Anziehung zwischen den negativ und positiv geladenen Teilen der Moleküle und der gegenseitigen Anziehung der hydrophoben Teile dazu, zusammenzuklumpen und auszufallen. Diesem Trend wird jedoch entgegengewirkt, dass sich in einer wässrigen Lösung Wassermoleküle, die polar sind, aufgrund der elektrostatischen Anziehung zwischen entgegengesetzt geladenen Teilen des Wassers und Proteinmolekülen tendenziell um die Proteinmoleküle herum anordnen. Dies führt dazu, dass die Proteinmoleküle getrennt gehalten werden und in Lösung bleiben, aber es gibt verschiedene Methoden, um eine Ausfällung von Proteinen zu erreichen.
Das am häufigsten verwendete Verfahren zur Proteinfällung ist die Zugabe einer Salzlösung, eine Technik, die oft als "Aussalzen" bezeichnet wird. Das am häufigsten verwendete Salz ist Ammoniumsulfat. Die Wechselwirkung der Salzionen mit Wassermolekülen beseitigt die Wasserbarriere zwischen Proteinmolekülen und ermöglicht den Kontakt der hydrophoben Teile des Proteins. Dies führt dazu, dass sich die Proteinmoleküle zusammenlagern und aus der Lösung ausfallen. Je höher das Molekulargewicht des Proteins ist, desto niedriger ist in der Regel die Konzentration des Salzes, das zur Ausfällung erforderlich ist, so dass es möglich ist, ein Gemisch verschiedener Proteine in Lösung zu trennen, indem die Salzkonzentration allmählich erhöht wird Verschiedene Proteine fallen in verschiedenen Stadien aus, ein Prozess, der als fraktionierte Ausfällung bezeichnet wird.
Die Löslichkeit eines Proteins in einem wässrigen Medium kann durch Einbringen eines organischen Lösungsmittels verringert werden. Dies bewirkt eine Reduzierung der Dielektrizitätskonstante, die in diesem Zusammenhang als Maß für die Polarität eines Lösungsmittels angesehen werden kann. Eine Verringerung der Polarität bedeutet, dass Lösungsmittelmoleküle weniger dazu neigen, sich um diejenigen des Proteins zu sammeln, so dass zwischen den Proteinmolekülen weniger Wasserbarrieren bestehen und eine größere Tendenz zur Proteinfällung besteht. Viele organische Lösungsmittel interagieren mit den hydrophoben Teilen der Proteinmoleküle und verursachen eine Denaturierung. Einige, wie Ethanol und Dimethylsulfoxid (DMSO), tun dies jedoch nicht.
Obwohl Proteine negativ und positiv geladene Teile aufweisen können, weisen sie in Lösung häufig eine positive oder negative Gesamtladung auf, die je nach pH-Wert variiert, und halten sie durch elektrostatische Abstoßung voneinander getrennt. Unter sauren Bedingungen weisen Proteine bei niedrigem pH-Wert tendenziell eine positive Gesamtladung auf, während bei hohem pH-Wert die Ladung negativ ist. Proteine haben einen Zwischenpunkt, an dem keine Gesamtladung vorliegt - dieser Punkt ist als isoelektrischer Punkt bekannt und liegt bei den meisten Proteinen im pH-Bereich von 4 bis 6. Der isoelektrische Punkt für ein gelöstes Protein kann durch Zugabe einer Säure, üblicherweise Salzsäure oder Schwefelsäure, erreicht werden, um den pH-Wert auf das geeignete Niveau zu senken, wodurch eine Clusterbildung und Ausfällung der Proteinmoleküle ermöglicht wird. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist, dass die Säuren dazu neigen, das Protein zu denaturieren, aber es wird oft verwendet, um unerwünschte Proteine zu entfernen.
Andere Verfahren zur Proteinfällung umfassen nichtionische hydrophile Polymere und Metallionen. Ersteres verringert die Menge an Wasser, die zur Bildung einer Barriere zwischen Proteinmolekülen zur Verfügung steht, wodurch diese zusammenklumpen und ausfallen können. Positiv geladene Metallionen können sich mit negativ geladenen Teilen des Proteinmoleküls verbinden, wodurch die Tendenz des Proteins verringert wird, eine Schicht von Wassermolekülen um sich herum anzuziehen, wodurch die Proteinmoleküle wieder miteinander in Wechselwirkung treten und aus der Lösung ausfallen können. Metallionen sind auch in sehr verdünnten Lösungen wirksam.