Vad är proteinutfällning?

Proteinutfällning är en metod som används för att extrahera och rena proteiner som hålls i en lösning. Stora, komplexa molekyler, proteiner har i allmänhet delar som har en negativ elektrisk laddning och delar som har en positiv laddning, liksom hydrofila och hydrofoba delar. Det finns en tendens att proteiner i lösning klumpas samman och fälls ut på grund av attraktionen mellan de negativt och positivt laddade delarna av molekylerna och den inbördes attraktionen av de hydrofoba delarna. Motverkande av denna tendens är emellertid det faktum att vattenmolekyler, som är polära, i en vattenlösning tenderar att ordna sig runt proteinmolekylerna på grund av den elektrostatiska attraktionen mellan motsatt laddade delar av vattnet och proteinmolekylerna. Detta resulterar i att proteinmolekylerna hålls isär och förblir i lösning, men det finns olika metoder för att uppnå utfällning av proteiner.

Den vanligaste metoden för proteinutfällning är genom att lägga till en lösning av ett salt, en teknik som ofta kallas "saltning ut". Det salt som oftast används är ammoniumsulfat. Interaktion mellan saltjoner och vattenmolekyler tar bort vattenbarriären mellan proteinmolekyler, vilket gör att de hydrofoba delarna av proteinet kan komma i kontakt. Detta resulterar i att proteinmolekylerna aggregeras tillsammans och fälls ut ur lösningen. Som en allmän regel, ju högre molekylvikt för proteinet, desto lägre är koncentrationen av saltet som krävs för att orsaka utfällning, så det är möjligt att separera en blandning av olika proteiner i lösning genom att gradvis öka saltkoncentrationen, så att olika proteiner fälls ut i olika stadier, en process känd som fraktionerad utfällning.

Lösligheten av ett protein i ett vattenhaltigt medium kan reduceras genom införande av ett organiskt lösningsmedel. Detta har effekten att minska den dielektriska konstanten, som i detta sammanhang kan betraktas som ett mått på ett lösningsmedels polaritet. En minskning av polariteten innebär att det finns en mindre tendens för lösningsmedelsmolekyler att klustera runt proteinets, så att det finns mindre en vattenbarriär mellan proteinmolekyler och en större tendens till proteinutfällning. Många organiska lösningsmedel interagerar med de hydrofoba delarna av proteinmolekyler, vilket orsakar denaturisering; emellertid gör vissa, såsom etanol och dimetylsulfoxid (DMSO) inte.

Även om proteiner kan ha negativt och positivt laddade delar, ofta, i lösning, kommer de att ha en total positiv eller negativ laddning som varierar beroende på pH och håller dem isär genom elektrostatisk avstötning. Vid sura förhållanden, med lågt pH, tenderar proteiner att ha en total positiv laddning, medan laddningen vid högt pH är negativ. Proteiner har en mellanliggande punkt där det inte finns någon total laddning - detta kallas den isoelektriska punkten och för de flesta proteiner ligger det i pH-intervallet 4-6. Den isoelektriska punkten för ett upplöst protein kan uppnås genom tillsats av en syra, vanligtvis saltsyra eller svavelsyra, för att reducera pH till lämplig nivå, vilket möjliggör kluster och utfällning av proteinmolekylerna. En nackdel med denna metod är att syrorna tenderar att denaturera proteinet, men det används ofta för att ta bort oönskade proteiner.

Andra metoder för proteinutfällning inkluderar icke-joniska hydrofila polymerer och metalljoner. De förstnämnda minskar mängden vatten tillgängligt för att bilda en barriär mellan proteinmolekyler, vilket tillåter dem att klumpa samman och fälla ut. Positivt laddade metalljoner kan binda till negativt laddade delar av proteinmolekylen, vilket reducerar proteinets tendens att locka till sig ett lager vattenmolekyler runt det, vilket igen låter proteinmolekylerna interagera med varandra och fälla ut ur lösningen. Metalljoner är effektiva även i mycket utspädda lösningar.