Hva er proteinutfelling?

Proteinutfelling er en metode som brukes til å trekke ut og rense proteiner som holdes i en løsning. Store, komplekse molekyler, proteiner har generelt deler som har en negativ elektrisk ladning og deler som har en positiv ladning, samt hydrofile og hydrofobe deler. Det er en tendens til at proteiner i løsning klumper seg sammen og utfeller ut på grunn av tiltrekningen mellom de negativt og positivt ladede delene av molekylene og den gjensidige tiltrekningen av de hydrofobe delene. Motvirkning av denne tendensen er imidlertid det faktum at i en vandig oppløsning vil vannmolekyler, som er polare, ha en tendens til å arrangere seg rundt proteinmolekylene på grunn av den elektrostatiske tiltrekningen mellom motsatt ladede deler av vannet og proteinmolekylene. Dette resulterer i at proteinmolekylene holdes fra hverandre og blir liggende i løsning, men det er forskjellige metoder for å oppnå utfelling av proteiner.

Den mest brukte metoden for proteinutfelling er ved å tilsette en løsning av et salt, en teknikk ofte referert til som "salting out". Saltet som oftest brukes er ammoniumsulfat. Samspillet mellom saltionene og vannmolekylene fjerner vannbarrieren mellom proteinmolekyler, slik at de hydrofobe delene av proteinet kan komme i kontakt. Dette resulterer i at proteinmolekylene aggregeres sammen og faller ut av løsningen. Som en generell regel, jo høyere molekylvekt på proteinet, jo lavere er konsentrasjonen av saltet som kreves for å forårsake utfelling, så det er mulig å skille en blanding av forskjellige proteiner i oppløsning ved gradvis å øke saltkonsentrasjonen, slik at forskjellige proteiner presipiterer i forskjellige stadier, en prosess kjent som fraksjonert nedbør.

Løseligheten av et protein i et vandig medium kan reduseres ved å innføre et organisk løsningsmiddel. Dette har effekten av å redusere den dielektriske konstanten, som i denne sammenheng kan betraktes som et mål på polariteten til et løsningsmiddel. En reduksjon i polaritet betyr at det er mindre en tendens til at løsningsmiddelmolekyler klynger seg rundt proteinets proteiner, slik at det er mindre en vannbarriere mellom proteinmolekyler og en større tendens til proteinutfelling. Mange organiske løsningsmidler interagerer med de hydrofobe delene av proteinmolekyler, noe som forårsaker denaturisering; noen, for eksempel etanol og dimetylsulfoksid (DMSO), gjør det imidlertid ikke.

Selv om proteiner kan ha negativt og positivt ladede deler, ofte, i løsning, vil de ha en samlet positiv eller negativ ladning som varierer i henhold til pH, og holder dem fra hverandre gjennom elektrostatisk frastøtning. Under sure forhold, med lav pH, har proteiner en tendens til å ha en total positiv ladning, mens ladningen er høy ved høy pH. Proteiner har et mellomliggende punkt der det ikke er noen generell ladning - dette er kjent som det isoelektriske punktet, og for de fleste proteiner ligger det i pH-området 4-6. Det isoelektriske punktet for et oppløst protein kan oppnås ved å tilsette en syre, vanligvis saltsyre eller svovelsyre, for å redusere pH-verdien til det passende nivået, noe som tillater clustering og utfelling av proteinmolekylene. En ulempe med denne metoden er at syrene har en tendens til å denaturere proteinet, men det blir ofte brukt til å fjerne uønskede proteiner.

Andre metoder for proteinutfelling inkluderer ikke-ioniske hydrofile polymerer og metallioner. Førstnevnte reduserer mengden vann som er tilgjengelig for å danne en barriere mellom proteinmolekyler, slik at de klumper seg sammen og bunnfaller. Positivt ladede metallioner kan binde seg til negativt ladede deler av proteinmolekylet, og redusere proteinets tendens til å tiltrekke seg et lag vannmolekyler rundt det, og igjen la proteinmolekylene samvirke med hverandre og felle ut av løsningen. Metallioner er effektive selv i veldig fortynnede løsninger.