Co je srážení proteinů?
Srážení proteinů je metoda používaná k extrakci a čištění proteinů držených v roztoku. Velké, komplexní molekuly, proteiny mají obecně části, které mají záporný elektrický náboj a části, které mají kladný náboj, jakož i hydrofilní a hydrofobní části. Proteiny v roztoku mají tendenci se shlukovat a vysrážet kvůli přitažlivosti mezi negativně a pozitivně nabitými částmi molekul a vzájemné přitažlivosti hydrofobních částí. Proti této tendenci je však skutečnost, že ve vodném roztoku budou mít molekuly vody, které jsou polární, tendenci se uspořádat kolem proteinových molekul kvůli elektrostatické přitažlivosti mezi opačně nabitými částmi molekuly vody a proteinu. To vede k tomu, že proteinové molekuly jsou udržovány odděleně a zůstávají v roztoku, ale existují různé způsoby pro dosažení srážení proteinů.
Nejběžněji používanou metodou srážení proteinů je přidání roztoku soli, což je technika, která se často označuje jako „solení“. Nejčastěji používanou solí je síran amonný. Interakce iontů soli s molekulami vody odstraňuje vodní bariéru mezi molekulami proteinu, což umožňuje hydrofobním částem proteinu přijít do styku. To má za následek agregaci proteinových molekul a vysrážení z roztoku. Obecně platí, že čím vyšší je molekulová hmotnost proteinu, tím nižší je koncentrace soli, která je nutná k vyvolání srážení, takže je možné oddělit směs různých proteinů v roztoku postupným zvyšováním koncentrace soli, takže různé proteiny se vysrážejí v různých stádiích, což je proces známý jako frakční srážení.
Rozpustnost proteinu ve vodném médiu může být snížena zavedením organického rozpouštědla. To má za následek snížení dielektrické konstanty, kterou lze v této souvislosti považovat za měřítko polarity rozpouštědla. Snížení polarity znamená, že molekuly rozpouštědla mají menší tendenci se shlukovat kolem molekul proteinu, takže mezi molekulami proteinu je menší vodní bariéra a větší tendence ke srážení proteinu. Mnoho organických rozpouštědel interaguje s hydrofobními částmi proteinových molekul, což způsobuje denaturaci; některé z nich, jako je ethanol a dimethylsulfoxid (DMSO), však ne.
Ačkoli proteiny mohou mít záporně a pozitivně nabité části, často v roztoku budou mít celkově pozitivní nebo negativní náboj, který se mění v závislosti na pH, a udržuje je odděleně elektrostatickým odpuzováním. V kyselých podmínkách s nízkým pH mají proteiny tendenci mít celkově pozitivní náboj, zatímco při vysokém pH je náboj záporný. Proteiny mají mezilehlý bod, ve kterém není celkový náboj - to je známé jako izoelektrický bod a pro většinu proteinů leží v rozmezí pH 4-6. Izoelektrického bodu pro rozpuštěný protein lze dosáhnout přidáním kyseliny, obvykle kyseliny chlorovodíkové nebo kyseliny sírové, aby se snížilo pH na vhodnou úroveň, což umožní shlukování a vysrážení molekul proteinu. Nevýhodou této metody je to, že kyseliny mají tendenci denaturovat protein, ale často se používá k odstranění nežádoucích proteinů.
Mezi další způsoby srážení proteinů patří neiontové hydrofilní polymery a kovové ionty. První z nich snižuje množství vody, která je k dispozici, aby vytvořila bariéru mezi molekulami proteinu, což jim umožní shluknout se a vysrážet. Pozitivně nabité kovové ionty se mohou spojit s negativně nabitými částmi proteinové molekuly, což snižuje tendenci proteinu přitahovat vrstvu molekul vody kolem něj, což opět umožňuje molekulám proteinu vzájemně interagovat a vysrážet se z roztoku. Kovové ionty jsou účinné i ve velmi zředěných roztocích.