Hvad er proteinudfældning?
Proteinudfældning er en metode, der bruges til at ekstrahere og rense proteiner, der holdes i en opløsning. Store, komplekse molekyler, proteiner har generelt dele, der har en negativ elektrisk ladning og dele, der har en positiv ladning, såvel som hydrofile og hydrofobe dele. Der er en tendens til, at proteiner i opløsning klumpes sammen og udfælder på grund af tiltrækningen mellem de negativt og positivt ladede dele af molekylerne og den gensidige tiltrækning af de hydrofobe dele. At modvirke denne tendens er imidlertid det faktum, at vandmolekyler, som er polære, i en vandig opløsning, vil have en tendens til at arrangere sig omkring proteinmolekylerne på grund af den elektrostatiske tiltrækning mellem modsat ladede dele af vandet og proteinmolekylerne. Dette resulterer i, at proteinmolekylerne holdes fra hinanden og forbliver i opløsning, men der er forskellige metoder til opnåelse af nedbør af proteiner.
Den mest almindeligt anvendte metode til proteinudfældning er ved at tilsætte en opløsning af et salt, en teknik, der ofte benævnes "salt ud." Det hyppigt anvendte salt er ammoniumsulfat. Interaktionen mellem saltioner med vandmolekyler fjerner vandbarrieren mellem proteinmolekyler, hvilket gør det muligt for de hydrofobe dele af proteinet at komme i kontakt. Dette resulterer i, at proteinmolekylerne samler sammen og udfælder ud af opløsningen. Som en generel regel, jo højere molekylvægt af proteinet, jo lavere er koncentrationen af det salt, der er nødvendigt for at forårsage nedbør, så det er muligt at adskille en blanding af forskellige proteiner i opløsning ved gradvist at øge saltkoncentrationen, så forskellige proteiner udfældes i forskellige stadier, en proces, der kaldes fraktional præcipitation.
opløseligheden af et protein i et vandigt medium kan reduceres ved at indføre et organisk opløsningsmiddel. Dette har den virkning at reducere thE dielektrisk konstant, som i denne sammenhæng kan betragtes som et mål for polariteten af et opløsningsmiddel. En reduktion i polaritet betyder, at der er mindre en tendens til opløsningsmiddelmolekyler til at klynge sig omkring proteinet, så der er mindre vandbarriere mellem proteinmolekyler og en større tendens til proteinudfældning. Mange organiske opløsningsmidler interagerer med de hydrofobe dele af proteinmolekyler, hvilket forårsager denaturisering; Nogle, såsom ethanol og dimethylsulfoxid (DMSO), gør imidlertid ikke.
Selvom proteiner kan have negativt og positivt ladede dele, ofte i opløsning, vil de have en samlet positiv eller negativ ladning, der varierer afhængigt af pH, og holder dem fra hinanden gennem elektrostatisk frastødelse. Under sure forhold, med en lav pH, har proteiner en tendens til at have en samlet positiv ladning, mens ladningen ved høj pH er ladningen negativ. Proteiner har et mellemliggende punkt, hvor der ikke er nogen samlet ladning - dette er kendt som den isoelektriske POINT og for de fleste proteiner ligger det i pH-området 4-6. Det isoelektriske punkt for et opløst protein kan nås ved tilsætning af en syre, normalt hydrochlorisk eller svovlsyre, for at reducere pH til det passende niveau, hvilket tillader klynger og nedbør af proteinmolekylerne. En ulempe ved denne metode er, at syrerne har en tendens til at denaturere proteinet, men det bruges ofte til at fjerne uønskede proteiner.
Andre metoder til proteinudfældning inkluderer ikke-ioniske hydrofile polymerer og metalioner. Førstnævnte reducerer den tilgængelige mængde vand til at danne en barriere mellem proteinmolekyler, så de kan klumpe sammen og udfælde. Positivt ladede metalioner kan binde sig med negativt ladede dele af proteinmolekylet, hvilket reducerer proteinets tendens til at tiltrække et lag vandmolekyler omkring det, hvilket igen tillader proteinmolekylerne at interagere med hinanden og udfælde ud af opløsningen. Metalioner er effektive, selv i meget fortyndede opløsninger.