Hvad er proteinudfældning?
Proteinudfældning er en metode, der anvendes til at ekstrahere og rense proteiner, der opbevares i en opløsning. Store, komplekse molekyler, proteiner har generelt dele, der har en negativ elektrisk ladning, og dele, der har en positiv ladning, såvel som hydrofile og hydrofobe dele. Der er en tendens til, at proteiner i opløsning klumper sig sammen og udfælder på grund af tiltrækningen mellem de negativt og positivt ladede dele af molekylerne og den gensidige tiltrækning af de hydrofobe dele. Modvirkning af denne tendens er imidlertid det faktum, at i en vandig opløsning vil vandmolekyler, som er polære, have en tendens til at arrangere sig omkring proteinmolekylerne på grund af den elektrostatiske tiltrækning mellem modsat ladede dele af vandet og proteinmolekylerne. Dette resulterer i, at proteinmolekylerne holdes adskilt og forbliver i opløsning, men der er forskellige metoder til opnåelse af udfældning af proteiner.
Den mest almindeligt anvendte metode til proteinudfældning er ved at tilføje en opløsning af et salt, en teknik, der ofte kaldes "saltning ud". Det mest hyppigt anvendte salt er ammoniumsulfat. Interaktion af saltionerne med vandmolekyler fjerner vandbarrieren mellem proteinmolekyler, hvilket tillader, at de hydrofobe dele af proteinet kommer i kontakt. Dette resulterer i, at proteinmolekylerne aggregeres sammen og udfældes ud af opløsningen. Som en generel regel, jo højere molekylvægt af proteinet er, jo lavere er koncentrationen af saltet, der kræves for at forårsage udfældning, så det er muligt at adskille en blanding af forskellige proteiner i opløsning ved gradvist at øge saltkoncentrationen, så forskellige proteiner præcipiterer i forskellige stadier, en proces, der er kendt som fraktioneret præcipitation.
Opløseligheden af et protein i et vandigt medium kan reduceres ved at indføre et organisk opløsningsmiddel. Dette har den virkning at reducere den dielektriske konstant, som i denne sammenhæng kan betragtes som et mål for polariteten af et opløsningsmiddel. En reduktion i polaritet betyder, at der er mindre en tendens til, at opløsningsmiddelmolekyler klynger sig omkring proteinerne, så der er mindre af en vandbarriere mellem proteinmolekyler og en større tendens til proteinudfældning. Mange organiske opløsningsmidler interagerer med de hydrofobe dele af proteinmolekyler, hvilket forårsager denaturisering; nogle, såsom ethanol og dimethylsulfoxid (DMSO), gør det imidlertid ikke.
Selvom proteiner kan have negativt og positivt ladede dele, ofte i opløsning, vil de have en samlet positiv eller negativ ladning, der varierer afhængigt af pH-værdien, og holder dem fra hinanden gennem elektrostatisk frastødning. Under sure forhold med lav pH-værdi har proteiner en tendens til at have en samlet positiv ladning, mens ladningen er negativ ved høj pH. Proteiner har et mellemliggende punkt, hvor der ikke er nogen samlet ladning - dette er kendt som det isoelektriske punkt, og for de fleste proteiner ligger det i pH-området 4-6. Det isoelektriske punkt for et opløst protein kan nås ved tilsætning af en syre, sædvanligvis saltsyre eller svovlsyre, for at reducere pH til det passende niveau, hvilket tillader klynge og udfældning af proteinmolekylerne. En ulempe ved denne metode er, at syrerne har en tendens til at denaturere proteinet, men det bruges ofte til at fjerne uønskede proteiner.
Andre metoder til proteinudfældning inkluderer ikke-ioniske hydrofile polymerer og metalioner. Førstnævnte reducerer mængden af vand til rådighed for at danne en barriere mellem proteinmolekyler, hvilket tillader dem at klumpe sig sammen og udfælde. Positivt ladede metalioner kan binde til negativt ladede dele af proteinmolekylet, hvilket reducerer proteinets tendens til at tiltrække et lag vandmolekyler omkring det, hvilket igen lader proteinmolekylerne interagere med hinanden og udfældes ud af opløsningen. Metalioner er effektive selv i meget fortyndede opløsninger.