Co je čištění peptidů?

Peptidy jsou malé polymery složené z aminokyselin. Mnoho z nich je biologicky aktivní jako hormony, toxiny nebo mají jiné schopnosti. Takové sloučeniny se často používají v biologickém, lékařském a chemickém výzkumu. Slouží také jako stavební kameny bílkovin, když je jich několik spojeno. Peptidové čištění je technika používaná buď k čištění velkého množství požadovaného peptidu, nebo k pomoci oddělit peptidy generované štěpením proteinů.

Čištění peptidů se provádí technikou chromatografie, což je způsob separace sloučenin, které se vážou odlišně na fyzikální matrici. K čištění peptidů se běžně používá vysokotlaká kapalinová chromatografie (HPLC). Peptid nebo peptidy jsou aplikovány ve směsi rozpouštědel, která se mění v čase, když jsou čerpána přes sloupec malých kuliček za vysokého tlaku. Různé peptidy se eluují v různých časových bodech a jsou detekovány monitorem, často UV spektrofotometrem.

Při provádění výzkumu peptidů je často zajímavá látka a nelze ji zakoupit od chemických společností. Pokud je známa struktura požadovaného peptidu, je často jednodušší připravit chemickou syntézu peptidu, než izolovat sloučeninu z přírodních zdrojů. Izolace přírodních produktů je notoricky obtížná. Syntetické peptidy se obecně čistí pomocí HPLC.

Taková chemická syntéza může být skličující pro nezávislého vědce, který není chemikem. Tento úkol je často zadáván společnostem syntézy peptidů, které se specializují na tyto techniky. To může být ekonomičtější než snaha o nastavení systému od nuly v laboratoři. Peptidové společnosti mohou přizpůsobit peptidy na míru potřebám výzkumného pracovníka.

Dalším důvodem purifikace peptidu může být situace, kdy výzkumný pracovník vyčistí protein a snaží se určit jeho identitu. Může degradovat protein na peptidové fragmenty, oddělit fragmenty purifikací a nechat fragmenty peptidů detekovat pomocí hmotnostního spektrometru při jejich eluce ze sloupce. Tato technika je známá jako LC-MS, zkratka pro kapalinovou chromatografii-hmotnostní spektrometrii. Poskytuje molekulovou hmotnost a aminokyselinové složení fragmentů a často umožňuje identifikaci proteinů, pokud byly dříve nebo dříve identifikovány podobné nebo identické proteiny.

Mnoho vědců pracuje s peptidy, které mají nové rysy, jako jsou například nepřirozené aminokyseliny, aby se pokusily najít ty, které mají neobvyklé biologické aktivity. Studii takových nových peptidů věnuje celé pole zvané peptidomimetika. Často jsou navrženy počítačem generované sekvence a je syntetizována knihovna peptidů, která zahrnuje řadu atypických peptidů. Purifikace peptidu se používá k oddělení jednotlivých členů této knihovny za poskytnutí čistého peptidu pro testování biologické aktivity. Tato strategie byla úspěšná při výrobě alespoň jednoho nového komerčně dostupného léku.

Mnoho biologicky aktivních peptidů je zajímavých pro lékařské použití. Komerčně používané sloučeniny, jako je inzulín, se běžně vyrábějí rekombinantními systémy s nadměrnou expresí DNA, které generují velká množství požadované sloučeniny. Peptidy jsou často geneticky upraveny tak, aby usnadňovaly purifikaci přidáním nějakého druhu značky do jejich front. To umožňuje použití afinitní chromatografie k čištění peptidu.

U tohoto typu chromatografie je značka látkou, jako je histidin, která bude vázat matrici kuliček, jako je nikl, vybraná pro svou schopnost vázat značku. Nežádoucí proteiny a peptidy obecně procházejí kolonou bez vazby. Specificky navržený peptid se obvykle silně váže na kolonu. Po vymytí kontaminujících proteinů a peptidů je požadovaný peptid eluován sloučeninou, která soutěží o vazbu na matrici. Jeden pak má poměrně čistý přípravek požadovaného peptidu a značku lze odstranit štěpením.