Wat is peptide-zuivering?
Peptiden zijn kleine polymeren samengesteld uit aminozuren. Velen zijn biologisch actief als hormonen, toxines of hebben andere vaardigheden. Dergelijke verbindingen worden vaak gebruikt in biologisch, medisch en chemisch onderzoek. Ze dienen ook als de bouwstenen van eiwitten wanneer aantallen ervan aan elkaar zijn gekoppeld. Peptidenzuivering is een techniek die wordt gebruikt om ofwel grote hoeveelheden van een gewenst peptide te zuiveren, of om te helpen bij het scheiden van peptiden die worden gegenereerd door de vertering van eiwitten.
De zuivering van peptiden wordt tot stand gebracht met behulp van een chromatografietechniek, een manier om verbindingen te scheiden die differentieel binden aan een fysische matrix. Hoge druk vloeistofchromatografie (HPLC) wordt gewoonlijk gebruikt voor peptidenzuivering. Het peptide of de peptiden worden aangebracht in een mengsel van oplosmiddelen dat in de loop van de tijd verandert terwijl ze onder hoge druk door een kolom met kleine korrels worden gepompt. Verschillende peptiden elueren op verschillende tijdstippen en worden gedetecteerd door een monitor, vaak een UV-spectrofotometer.
Bij het uitvoeren van onderzoek naar peptiden is de interessante stof vaak zeldzaam en kan deze niet worden gekocht bij chemische bedrijven. Als de structuur van het gewenste peptide bekend is, is het vaak gemakkelijker om chemisch te bereiden door peptidesynthese dan om de verbinding uit natuurlijke bronnen te isoleren. Isolatie van natuurlijke producten is notoir moeilijk. Synthetische peptiden worden in het algemeen gezuiverd met HPLC.
Een dergelijke chemische synthese kan ontmoedigend zijn voor een onafhankelijke onderzoeker die geen chemicus is. Vaak wordt deze taak uitbesteed aan peptidesynthese-bedrijven die gespecialiseerd zijn in deze technieken. Dit kan voordeliger zijn dan proberen het systeem helemaal opnieuw op te zetten in een laboratorium. Peptide-bedrijven kunnen aangepaste peptiden maken die zijn afgestemd op de behoeften van de onderzoeker.
Een andere reden voor peptidenzuivering kan zijn wanneer een onderzoeker een eiwit heeft gezuiverd en probeert zijn identiteit te bepalen. Hij of zij kan het eiwit afbreken in peptidefragmenten, de fragmenten scheiden door zuivering en het fragmentatiepatroon van de peptiden laten detecteren door een massaspectrometer terwijl ze uit de kolom elueren. Deze techniek staat bekend als LC-MS, kort voor vloeistofchromatografie-massaspectrometrie. Het geeft het molecuulgewicht en de aminozuursamenstelling van de fragmenten en maakt vaak de identificatie van eiwitten mogelijk, als soortgelijke of identieke eerder zijn geïdentificeerd.
Veel onderzoekers werken met peptiden met nieuwe kenmerken, zoals onnatuurlijke aminozuren, om te proberen die met ongebruikelijke biologische activiteiten te vinden. Er is een heel veld genaamd peptidomimetica gewijd aan de studie van dergelijke nieuwe peptiden. Vaak worden computer-gegenereerde sequenties ontworpen en wordt een peptidebibliotheek gesynthetiseerd die een reeks atypische peptiden omvat. Peptidenzuivering wordt gebruikt om afzonderlijke leden van deze bibliotheek te scheiden om zuiver peptide te verschaffen om te testen op biologische activiteit. Deze strategie is erin geslaagd ten minste één nieuw in de handel verkrijgbaar geneesmiddel te genereren.
Veel van de biologisch actieve peptiden zijn van belang voor medisch gebruik. Commercieel gebruikte verbindingen, zoals insuline, worden gewoonlijk geproduceerd door recombinante DNA-overexpressiesystemen die grote hoeveelheden van de gewenste verbinding genereren. Vaak zijn de peptiden genetisch gemanipuleerd om zuivering te vergemakkelijken door een soort label aan hun fronten toe te voegen. Dit maakt het gebruik van affiniteitschromatografie mogelijk om het peptide te zuiveren.
Met dit type chromatografie is de tag een verbinding, zoals histidine, die een matrix van kralen, zoals nikkel, zal binden, gekozen vanwege zijn vermogen om de tag te binden. Ongewenste eiwitten en peptiden passeren in het algemeen de kolom zonder te binden. Het specifiek ontworpen peptide bindt meestal sterk aan de kolom. Nadat de verontreinigende eiwitten en peptiden zijn afgewassen, wordt het gewenste peptide geëlueerd door een verbinding die concurreert voor binding aan de matrix. Men heeft dan een redelijk zuivere bereiding van het gewenste peptide en het label kan worden verwijderd door splitsing.