Cos'è la purificazione del peptide?
I peptidi sono piccoli polimeri composti da aminoacidi. Molti sono biologicamente attivi come ormoni, tossine o hanno altre capacità. Tali composti sono frequentemente utilizzati nella ricerca biologica, medica e chimica. Servono anche come elementi costitutivi delle proteine quando un numero di esse è collegato tra loro. La purificazione del peptide è una tecnica utilizzata per purificare grandi quantità di un peptide desiderato o per aiutare a separare i peptidi generati dalla digestione delle proteine.
La purificazione dei peptidi viene effettuata utilizzando una tecnica di cromatografia, un modo per separare i composti che si legano in modo diverso a una matrice fisica. La cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) viene comunemente utilizzata per la purificazione dei peptidi. Il peptide o i peptidi vengono applicati in una miscela di solventi che cambia nel tempo mentre vengono pompati attraverso una colonna di piccoli granuli ad alta pressione. Peptidi diversi eluiscono in diversi punti temporali e vengono rilevati da un monitor, spesso uno spettrofotometro UV.
Quando si conducono ricerche sui peptidi, spesso la sostanza di interesse è rara e non può essere acquistata da aziende chimiche. Se la struttura del peptide desiderato è nota, è spesso più facile prepararsi chimicamente mediante sintesi di peptidi piuttosto che isolare il composto da fonti naturali. L'isolamento dei prodotti naturali è notoriamente difficile. I peptidi sintetici sono generalmente purificati mediante HPLC.
Tale sintesi chimica può essere scoraggiante per un ricercatore indipendente che non è un chimico. Spesso questo compito è affidato a società di sintesi peptidica specializzate in queste tecniche. Questo può essere più economico rispetto al tentativo di configurare il sistema da zero in un laboratorio. Le aziende di peptidi possono realizzare peptidi personalizzati su misura per le esigenze del ricercatore.
Un altro motivo per la purificazione del peptide può essere quando un ricercatore ha purificato una proteina e sta cercando di determinarne l'identità. Lui o lei può degradare la proteina in frammenti di peptidi, separare i frammenti per purificazione e avere il modello di frammentazione dei peptidi rilevato da uno spettrometro di massa mentre eluiscono dalla colonna. Questa tecnica è nota come LC-MS, abbreviazione di cromatografia liquida-spettrometria di massa. Fornisce il peso molecolare e la composizione aminoacidica dei frammenti e spesso consente l'identificazione di proteine, se simili o identici sono stati identificati in precedenza.
Molti ricercatori lavorano con peptidi che hanno nuove caratteristiche, come aminoacidi innaturali, per cercare di trovare quelli con attività biologiche insolite. C'è un intero campo chiamato peptidomimetica dedicato allo studio di tali nuovi peptidi. Spesso vengono progettate sequenze generate al computer e viene sintetizzata una libreria di peptidi che comprende una gamma di peptidi atipici. La purificazione del peptide viene utilizzata per separare i singoli membri di questa libreria per fornire peptide puro per testare l'attività biologica. Questa strategia ha avuto successo nel generare almeno un nuovo farmaco disponibile in commercio.
Molti dei peptidi biologicamente attivi sono di interesse per usi medici. I composti usati commercialmente, come l'insulina, sono comunemente prodotti dai sistemi di sovraespressione del DNA ricombinante che generano grandi quantità del composto desiderato. Spesso i peptidi sono geneticamente modificati per facilitare la purificazione aggiungendo una sorta di tag ai loro fronti. Ciò consente l'uso della cromatografia di affinità per purificare il peptide.
Con questo tipo di cromatografia, il tag è un composto, come l'istidina, che legherà una matrice di perline, come il nichel, scelto per la sua capacità di legare il tag. Le proteine e i peptidi indesiderati generalmente passano attraverso la colonna senza legarsi. Il peptide appositamente progettato di solito si lega fortemente alla colonna. Dopo che le proteine e i peptidi contaminanti sono stati lavati via, il peptide desiderato viene eluito da un composto che compete per legarsi alla matrice. Uno ha quindi una preparazione abbastanza pura del peptide desiderato e il tag può essere rimosso mediante scissione.