Cos'è la purificazione peptidica?
I peptidi sono piccoli polimeri composti da aminoacidi. Molti sono biologicamente attivi come ormoni, tossine o altre abilità. Tali composti sono spesso utilizzati nella ricerca biologica, medica e chimica. Servono anche come elementi costitutivi delle proteine quando il numero di esse è collegato insieme. La purificazione del peptide è una tecnica utilizzata per purificare grandi quantità di peptide desiderato o per aiutare a separare i peptidi generati dalla digestione delle proteine.
La purificazione dei peptidi viene realizzata usando una tecnica di cromatografia, un modo per separare i composti che si legano in differenzialmente alla matrice fisica. La cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) è comunemente usata per la purificazione dei peptidi. Il peptide o i peptidi vengono applicati in una miscela di solventi che cambia nel tempo mentre vengono pompati attraverso una colonna di piccole perle ad alta pressione. Peptidi diversi eluiranno in punti temporali diversi e vengono rilevati da un monitor, spesso uno spettrofotometro UV.
Quando conducono ricerche sui peptidi, spesso la sostanza di interesse è rara e non può essere acquistata da aziende chimiche. Se è nota la struttura del peptide desiderato, è spesso più facile preparare chimicamente mediante sintesi del peptide che isolare il composto da fonti naturali. I prodotti naturali l'isolamento è notoriamente difficile. I peptidi sintetici sono generalmente purificati da HPLC.
Tale sintesi chimica può essere scoraggiante per un ricercatore indipendente che non è un chimico. Spesso, questo compito è contratto da società di sintesi peptidica specializzate in queste tecniche. Questo può essere più economico del tentativo di impostare il sistema da zero in un laboratorio. Le aziende peptidiche possono realizzare peptidi personalizzati su misura per le esigenze del ricercatore.
Un altro motivo per la purificazione del peptide può essere quando un ricercatore ha purificato una proteina e sta cercando di determinare il suo identity. Lui o lei può degradare la proteina in frammenti di peptidi, separare i frammenti mediante purificazione e avere il modello di frammentazione dei peptidi rilevati da uno spettrometro di massa mentre eludono dalla colonna. Questa tecnica è nota come LC-MS, abbreviazione della spettrometria di massa cromatografica liquida. Dà il peso molecolare e la composizione degli aminoacidi dei frammenti e spesso consente l'identificazione di proteine, se simili o identiche sono state identificate in precedenza.
Molti ricercatori lavorano con peptidi che hanno caratteristiche nuove, come gli aminoacidi innaturali, per cercare di trovarli con attività biologiche insolite. Esiste un intero campo chiamato peptidomimetics dedicato allo studio di tali nuovi peptidi. Spesso sono progettate sequenze generate dal computer e viene sintetizzata una libreria di peptidi che comprende una gamma di peptidi atipici. La purificazione del peptide viene utilizzata per separare i singoli membri di questa biblioteca per fornire peptide puro per testare ACTI biologicivarietà. Questa strategia ha avuto successo nel generare almeno un nuovo farmaco disponibile in commercio.
Molti dei peptidi biologicamente attivi sono interessanti per gli usi medici. I composti utilizzati commercialmente, come l'insulina, sono comunemente prodotti dai sistemi di sovraespressione di DNA ricombinanti che generano grandi quantità del composto desiderato. Spesso, i peptidi sono geneticamente progettati per facilitare la purificazione facendo aggiungere una sorta di tag ai loro fronti. Ciò consente all'uso della cromatografia di affinità di purificare il peptide.
Con questo tipo di cromatografia, il tag è un composto, come l'istidina, che legherà una matrice di perline, come il nichel, scelto per la sua capacità di legare il tag. Le proteine e i peptidi indesiderati generalmente passano attraverso la colonna senza legame. Il peptide appositamente progettato di solito si lega fortemente alla colonna. Dopo che le proteine e i peptidi contaminanti sono stati lavati, il peptide desiderato è eluito da un composto per cui competelegame alla matrice. Uno ha quindi una preparazione abbastanza pura del peptide desiderato e il tag può essere rimosso per scissione.