O que é purificação de peptídeo?
Os peptídeos são pequenos polímeros compostos por aminoácidos. Muitos são biologicamente ativos como hormônios, toxinas ou têm outras habilidades. Tais compostos são freqüentemente usados em pesquisas biológicas, médicas e químicas. Eles também servem como os blocos de construção das proteínas quando um número delas está ligado. A purificação de peptídeos é uma técnica usada para purificar grandes quantidades de um peptídeo desejado ou para ajudar a separar peptídeos gerados a partir da digestão de proteínas.
A purificação de peptídeos é realizada usando uma técnica de cromatografia, uma maneira de separar compostos que se ligam diferencialmente a uma matriz física. A cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) é comumente usada para purificação de peptídeos. O peptídeo ou peptídeos são aplicados em uma mistura de solventes que muda ao longo do tempo à medida que são bombeados através de uma coluna de pequenas esferas a alta pressão. Diferentes peptídeos são eluídos em momentos variados e são detectados por um monitor, freqüentemente um espectrofotômetro UV.
Ao realizar pesquisas sobre peptídeos, muitas vezes a substância de interesse é rara e não pode ser comprada de empresas químicas. Se a estrutura do peptídeo desejado é conhecida, é frequentemente mais fácil preparar quimicamente por síntese peptídica do que isolar o composto de fontes naturais. O isolamento de produtos naturais é notoriamente difícil. Os peptídeos sintéticos são geralmente purificados por HPLC.
Essa síntese química pode ser assustadora para um pesquisador independente que não é químico. Freqüentemente, essa tarefa é contratada para empresas de síntese de peptídeos que se especializam nessas técnicas. Isso pode ser mais econômico do que tentar configurar o sistema do zero em um laboratório. As empresas de peptídeos podem fabricar peptídeos personalizados, adaptados às necessidades do pesquisador.
Outro motivo para a purificação de peptídeos pode ser quando um pesquisador purifica uma proteína e está tentando determinar sua identidade. Ele ou ela pode degradar a proteína em fragmentos peptídicos, separar os fragmentos por purificação e ter o padrão de fragmentação dos peptídeos detectados por um espectrômetro de massa à medida que eluem da coluna. Esta técnica é conhecida como LC-MS, abreviação de cromatografia líquida-espectrometria de massa. Dá o peso molecular e a composição de aminoácidos dos fragmentos e, muitas vezes, permite a identificação de proteínas, se identificadas anteriormente ou similares.
Muitos pesquisadores trabalham com peptídeos que apresentam características novas, como aminoácidos não naturais, para tentar encontrar aqueles com atividades biológicas incomuns. Existe um campo inteiro chamado peptidomiméticos dedicado ao estudo desses novos peptídeos. Freqüentemente, sequências geradas por computador são projetadas e uma biblioteca de peptídeos é sintetizada que abrange uma variedade de peptídeos atípicos. A purificação de peptídeo é usada para separar membros individuais desta biblioteca para fornecer peptídeo puro para testar a atividade biológica. Essa estratégia foi bem-sucedida na geração de pelo menos um novo medicamento disponível comercialmente.
Muitos dos peptídeos biologicamente ativos são de interesse para usos médicos. Os compostos utilizados comercialmente, como a insulina, são comumente produzidos por sistemas de superexpressão de DNA recombinante que geram grandes quantidades do composto desejado. Freqüentemente, os peptídeos são geneticamente modificados para facilitar a purificação, adicionando algum tipo de etiqueta às suas frentes. Isso permite o uso de cromatografia de afinidade para purificar o peptídeo.
Com esse tipo de cromatografia, o marcador é um composto, como a histidina, que liga uma matriz de pérolas, como o níquel, escolhido por sua capacidade de vincular o marcador. Proteínas e peptídeos indesejados geralmente passam através da coluna sem ligação. O peptídeo especificamente projetado geralmente se liga fortemente à coluna. Após a lavagem das proteínas e peptídeos contaminantes, o peptídeo desejado é eluído por um composto que compete pela ligação à matriz. Um deles tem então uma preparação bastante pura do peptídeo desejado, e o marcador pode ser removido por clivagem.