Co je to polyakrylamidový gel?
Polyakrylamidový gel je roztok běžně používaný v elektroforéze, při procesu oddělování molekul nebo částic různé velikosti jejich průchodem gelem a přiváděním elektrického proudu. Pro polyakrylamidový gel existují různé recepty, ale obvykle obsahuje akrylamid, vodu, pufr, persíran amonný (APS) a tetramethylethylendiamin (TEMED). Tento gel funguje jako matrice, která odděluje sloučeniny na základě jejich náboje a velikosti; čím více akrylamidu v gelovém roztoku, tím lepší separace menších molekul. Typicky se tento gel používá pro separaci proteinů a DNA.
Při elektroforéze způsobuje elektrické pole pohybující se nabité částice gelem, který funguje jako síto a způsobuje separaci částic různých velikostí. Gel absorbuje veškeré teplo produkované elektrickým proudem. Při tomto postupu se běžně používá polyakrylamidový gel, ale lze také použít agarózu, další chemikálii, která vytváří podobný gel.
Gely mohou být vyrobeny s různou koncentrací, přičemž množství akrylamidu je v rozmezí od asi 6% do 15%. Při míchání gelu je akrylamid nepolymerizovaný, což znamená, že zůstává jako jednotlivé molekuly. Přidání dalších chemikálií, které podporují vazbu, jako je TEMED, způsobí, že se molekuly spojí a vytvoří dlouhé řetězce - „poly“ část polyakrylamidu.
Hlavní výhodou polyakrylamidového gelu je to, že počet vazebních vazeb a tvrdost lze regulovat na základě počátečního množství akrylamidu a přidaného TEMEDu. Hlavním faktorem koncentrace akrylamidu je velikost analyzované molekuly. Čím menší jsou separované sloučeniny, tím více akrylamidu je potřeba; velmi malé částice se oddělí pomocí nejvyšší koncentrace, 15 procent.
Akrylamid pracuje tak, že reguluje množství tření v gelu; tvrdost gelu určuje množství tření. Sloučeniny, které jsou velké, se budou pohybovat gelem pomaleji, protože v důsledku jejich velikosti je přirozeně větší tření nebo odpor. Menší sloučeniny se pohybují rychleji, protože dochází k menšímu tření. Aby se zabránilo malým sloučeninám v pohybu z gelu, přidává se více akrylamidu, aby se vytvořilo větší tření.
DNA polyakrylamidový gel se používá k oddělení řetězců DNA různé délky. Kousky DNA se oddělí pouze jedním nukleotidem, sloučeniny, které tvoří každý řetězec. Abychom věděli, které kusy se vztahují ke specifickým velikostem, standard, který obsahuje fragmenty o známé velikosti, se běžně provádí společně se vzorky. Kusy DNA se pak porovnají se standardem a stanoví se velikost vlákna.
Podobný postup se používá ke stanovení velikosti bílkovin, nejčastěji bílkovin v krvi. Krev obsahuje dva hlavní typy proteinů: globulin, protein velké velikosti a sérový albumin, velmi malý, negativně nabitý protein. Pro stanovení množství každého typu se používá separace pomocí polyakrylamidového gelu.