Was ist Shotgun Sequencing?
Die Shotgun-Sequenzierung ist eine Methode zur DNA-Sequenzierung, bei der ein langer DNA-Abschnitt physikalisch in kleine Fragmente (ca. 2.000 Basenpaare) zerlegt wird, die mittels Computeranalyse kloniert, sequenziert und zusammengesetzt werden. Es wurde von Craig Venter von der Celera Corporation entwickelt und berühmt gemacht. Venter entwickelte die Technik 1996 während seiner Arbeit am Institut für Genomforschung.
Venter gründete Celera 1998 mit dem Ziel, das menschliche Genom innerhalb von drei Jahren zu sequenzieren. Dieses Ziel stand in direktem Wettbewerb mit dem bereits laufenden Human Genome Project, einem Konsortium von Universitäten, die zusammenarbeiten, um das menschliche Genom mithilfe einer älteren Strategie zu sequenzieren, die als kartenbasierte oder BAC-zu-BAC-Sequenzierung bezeichnet wird. Diese Methode umfasste zunächst das Aufteilen des Genoms in 150.000 Basenpaarstücke, die als BACs bezeichnet werden, das Zusammensetzen der BACs in der angegebenen Reihenfolge und das anschließende detaillierte Sequenzieren jedes BAC.
Die vollständige Genom-Shotgun-Sequenzierung umgeht die Erstellung und Kartierung von BACs und beginnt direkt mit der DNA-Sequenzierung. Der Prozess beginnt mit der Gewinnung einer Probe von hochmolekularer DNA aus dem interessierenden Organismus und deren physikalischer Zerlegung durch Hindurchführen durch eine Schmalspritze oder Beschallung, um die Probe mit Schallwellen zu zerbrechen. Das Scheren ist ein zufälliger Vorgang, sodass sich die Sequenzen der Fragmente etwas überlappen. Das Scheren erzeugt nicht spezifisch die 2.000 Basenpaarfragmente, die zur Sequenzierung benötigt werden, vielmehr müssen Fragmente der gewünschten Größe aus der Mischung gereinigt werden.
Der nächste Schritt besteht darin, die DNA-Fragmente mit Träger-DNA zu verbinden, die als Vektor bezeichnet wird. Dieser Prozess wird als Klonen bezeichnet und erstellt eine Sequenzierungsbibliothek, aus der die Sequenz eines gesamten Genoms erstellt wird. Die Sequenz jedes Klons in der Bibliothek wird bestimmt und eine Computeranalyse wird verwendet, um überlappende oder kontinuierliche Sequenzen in jedem Fragment zu finden. Durch das Zusammenfügen der Überlappungen entsteht ein „Contig“, ein langer, kontinuierlicher Abschnitt der DNA-Sequenz.
Das Klonen von Schrotflinten führt normalerweise zu einigen Lücken zwischen den Contigs, da einige Sequenzen zufällig in der Bibliothek fehlen. Lücken können gefüllt werden, indem eine neue Bibliothek erstellt oder bekannte Sequenzen verwendet werden, um sich vom Contig nach außen zu erstrecken. Da die Shotgun-Sequenzierung DNA-Fragmente nach dem Zufallsprinzip sequenziert, werden viele Fragmente mehr als einmal sequenziert, was eine größere Sicherheit dafür schafft, dass die Sequenz korrekt ist, als wenn jedes Fragment nur ein- oder zweimal sequenziert worden wäre.
Das humane Genom wurde sowohl vom Human Genome Project mittels kartenbasierter Sequenzierung als auch von Celera mittels Shotgun-Sequenzierung sequenziert. Die Shotgun-Sequenzierung ist jetzt die bevorzugte Methode für andere Arten der Genomsequenzierung. Auf diese Weise wurden die vollständigen Genome vieler Organismen wie der Pflanze Arabidopsis thaliana , Reis, der Kuh, Hund, Huhn, Schimpanse, Ratte, Maus, Kugelfisch und vieler Mikroorganismen sequenziert.