Was ist eine Schrotflintensequenzierung?
Shotgun-Sequenzierung ist eine Methode zur DNA-Sequenzierung, bei der ein langer DNA-Abschnitt physisch in kleine (ungefähr 2.000 Basispaar-) Fragmente unterteilt ist, die unter Verwendung der Computeranalyse kloniert, sequenziert und zusammengestellt werden. Es wurde entwickelt und berühmt von Craig Venter von der Celera Corporation. Venter entwickelte die Technik 1996, während er am Institut für Genomforschung arbeitete.
Venter gründete Celera 1998 mit der Mission, das menschliche Genom innerhalb von drei Jahren zu sequenzieren. Dieses Ziel war im direkten Wettbewerb mit dem bereits operativen Projekt des menschlichen Genoms, einem Konsortium von Universitäten, die zusammenarbeiten, um das menschliche Genom mit einer älteren Strategie namens MAP-basiert oder BAC-to-BAC-Sequenzierung zu sequenzieren. Diese Methode beinhaltete zuerst das Genom in 150.000 Basenpaarstücke, die BACs bezeichneten, die BACs in der Reihenfolge zusammenstellten und dann jeden BAC detailliert sequenzieren.Der Prozess beginnt mit dem Erwerb einer Probe von DNA mit hohem Molekulargewicht aus dem interessierenden Organismus und bricht sie physisch in kleine Stücke durch, indem sie sie durch eine schmale Spurspritze verlässt oder sie sondergeht, eine Möglichkeit, die Probe mit Schallwellen zu brechen. Scherung ist ein zufälliger Prozess, daher haben die Sequenzen der Fragmente eine gewisse Überlappung zwischen ihnen. Das Scheren erzeugt nicht spezifisch die für die Sequenzierung benötigten 2.000 Basispaarfragmente, sondern Fragmente der gewünschten Größe müssen aus der Mischung gereinigt werden.
Der nächste Schritt besteht darin, den DNA -Fragmenten mit der Carrier -DNA, die als Vektor bezeichnet wird, zu verbinden. Dieser Prozess wird als Klonen bezeichnet und erstellt eine Sequenzierungsbibliothek, aus der die Abfolge eines gesamten Genoms erzeugt wird. Die Sequenz jedes Klons in der Bibliothek wird bestimmt und die Computeranalyse wird verwendet, um überlappende oder kontinuierliche Sequenzen in jedem Fragment zu finden. Zusammenstellung der Überlappungen cwiederholt einen „Contig“, was ein langer kontinuierlicher Abschnitt der DNA -Sequenz ist.
Schrotflintenklone führen normalerweise zu einigen Lücken zwischen Contigs, da einige Sequenzen in der Bibliothek zufällig fehlen. Lücken können durch Erstellen einer neuen Bibliothek oder durch Verwendung bekannter Sequenzen gefüllt werden, um sich vom Contig nach außen zu erstrecken. Da Schrotflintensequenzierungssequenzierungssequenzen DNA -Fragmente zufällig sind, werden viele Fragmente mehr als einmal sequenziert, was eine größere Gewissheit erzeugt, dass die Sequenz korrekt ist, als wenn jedes Fragment nur ein- oder zweimal sequenziert wurde.
Das menschliche Genom wurde sowohl durch das Human-Genom-Projekt unter Verwendung der MAP-basierten Sequenzierung als auch durch Celera unter Verwendung einer Schrotflintensequenzierung sequenziert. Die Schrotflintensequenzierung ist jetzt die bevorzugte Methode für andere Arten der Genomsequenzierung. Die vollen Genome vieler Organismen, wie der Pflanze Arabidopsis thaliana , Reis, Kuh, Hund, Hühnchen, Schimpansen, Ratten, Maus, Kugelfisch und vielen Mikroorganismen wurden auf diese Weise sequenziert.