Co je sekvenování brokovnice?
Brokovnice Sekvenování je metoda sekvenování DNA, při které je dlouhý úsek DNA fyzicky rozdělen na malé (přibližně 2 000 párů bází) fragmenty, které jsou klonovány, sekvenovány a sestaveny pomocí počítačové analýzy. Byl vyvinut a proslaven Craigem Venterem z Celera Corporation. Venter tuto techniku vyvinul v roce 1996 při práci na Institutu pro výzkum genomu.
Venter založil Celeru v roce 1998 s posláním sekvencovat lidský genom do tří let. Tento cíl byl v přímé konkurenci s již fungujícím projektem Human Genome Project, konsorciem univerzit spolupracujících na sekvenci lidského genomu pomocí starší strategie zvané mapování nebo BAC-to-BAC. Tato metoda zahrnovala nejprve rozdělení genomu na 150 000 kusů párů bází zvaných BAC, sestavení BAC v pořádku a následné sekvenování každého BAC v detailu.
Sekvenování celého genomu brokovnice obchází vytváření a mapování BAC a začíná přímo sekvenováním DNA. Proces začíná získáním vzorku DNA s vysokou molekulovou hmotností z organizmu, který je předmětem zájmu, a fyzickým rozdělením na malé kousky průchodem přes stříkačku s úzkým kalibrem nebo sonikací, což je způsob, jak rozbít vzorek pomocí zvukových vln. Střih je náhodný proces, takže sekvence fragmentů se budou mezi nimi částečně překrývat. Stříhání nevytváří specificky fragmenty 2 000 párů bází potřebné pro sekvenování, ale fragmenty požadované velikosti musí být ze směsi vyčištěny.
Dalším krokem je spojení DNA fragmentů s DNA nosiče zvanou vektor. Tento proces se nazývá klonování a vytváří sekvenční knihovnu, ze které se vytvoří sekvence celého genomu. Stanoví se sekvence každého klonu v knihovně a počítačová analýza se použije k nalezení překrývajících se nebo nepřetržitých sekvencí v každém fragmentu. Sestavení překrývání vytvoří „kontig“, což je dlouhý souvislý úsek DNA sekvence.
Klonování brokovnic obvykle povede k určitým mezerám mezi kontigy, protože některé sekvence náhodou chybí v knihovně. Mezery mohou být vyplněny vytvořením nové knihovny nebo použitím známých sekvencí, které vyčnívají ven z kontig. Protože sekvenční fragmenty DNA brokovnice náhodně, mnoho fragmentů je sekvenováno více než jednou, což vytváří větší jistotu, že sekvence je správná, než kdyby každý fragment byl sekvenován pouze jednou nebo dvakrát.
Lidský genom byl sekvenován jak projektem Human Genome Project pomocí mapování na základě mapy, tak Celera pomocí brokovnice. Shotgunové sekvenování je nyní preferovanou metodou pro jiné druhy sekvenování genomu. Tímto způsobem byly sekvenovány celé genomy mnoha organismů, jako je rostlina Arabidopsis thaliana , rýže, kráva, pes, kuře, šimpanz, krysa, myš, pufferfish a mnoho mikroorganismů.