Vad är Shotgun Sequencing?

Hagelgevärsekvensering är en metod för DNA-sekvensering varigenom en lång DNA-sträckning fysiskt bryts i små (ungefär 2000 baspar) fragment som klonas, sekvenseras och monteras med hjälp av datoranalys. Det utvecklades och berömdes av Craig Venter från Celera Corporation. Venter utvecklade tekniken 1996 när han arbetade vid Institute for Genome Research.

Venter grundade Celera 1998 med uppdraget att sekvensera det mänskliga genomet inom tre år. Detta mål var i direkt konkurrens med det redan fungerande Human Genome Project, ett konsortium av universitet som arbetar tillsammans för att sekvensera det mänskliga genomet med hjälp av en äldre strategi som kallas kartbaserad eller BAC-till-BAC-sekvensering. Denna metod involverade först att bryta genomet i 150 000 basparstycken, BAC: er, sammansätta BAC: erna i ordning och sedan sekvensbestämma varje BAC i detalj.

Hela genomskottets sekvensering kringgår skapandet och kartläggningen av BAC: er och börjar direkt med DNA-sekvensering. Processen börjar med att skaffa ett prov av DNA med hög molekylvikt från den intressanta organismen och fysiskt bryta det i små bitar genom att leda det genom en smal spets eller spruta det, ett sätt att bryta provet med ljudvågor. Klippning är en slumpmässig process, så sekvenserna för fragmenten kommer att ha viss överlappning mellan dem. Skjuvning skapar inte specifikt de 2 000 basparfragmenten som behövs för sekvensering, snarare måste fragment av önskad storlek renas från blandningen.

Nästa steg är att förena DNA-fragmenten med bärar-DNA som kallas en vektor. Denna process kallas kloning, och den skapar ett sekvensbibliotek från vilket sekvensen för ett helt genom skapas. Sekvensen för varje klon i biblioteket bestäms och dataanalys används för att hitta överlappande eller kontinuerliga sekvenser i varje fragment. Att sätta ihop överlappningarna skapar en "contig", som är en lång kontinuerlig DNA-sekvenssträcka.

Kloning av hagelgevär kommer vanligtvis att resultera i vissa luckor mellan konturer eftersom vissa sekvenser saknas från biblioteket av en slump. Spalter kan fyllas genom att skapa ett nytt bibliotek eller genom att använda kända sekvenser för att sträcka sig utåt från kontigen. Eftersom hagelgevärsekvenssekvenser DNA-fragment slumpmässigt sekvenseras många fragment mer än en gång, vilket skapar större säkerhet om att sekvensen är korrekt än om varje fragment bara hade sekvenserats en eller två gånger.

Det mänskliga genomet sekvenserades både genom Human Genome-projektet med användning av kartbaserad sekvensering och av Celera med användning av hagelgevärsekvensering. Hagelgevarssekvensering är nu den föredragna metoden för andra typer av genomsekvensering. De fullständiga genomerna av många organismer, såsom växten Arabidopsis thaliana , ris, ko, hund, kyckling, schimpans, råtta, mus, pufferfisk och många mikroorganismer har sekvenserats på detta sätt.