O que é o sequenciamento de espingarda?
O sequenciamento de espingarda é um método de sequenciamento de DNA, pelo qual um longo trecho de DNA é fisicamente quebrado em pequenos fragmentos (aproximadamente 2.000 pares de bases) que são clonados, sequenciados e montados usando análise de computador. Foi desenvolvido e ficou famoso por Craig Venter, da Celera Corporation. Venter desenvolveu a técnica em 1996 enquanto trabalhava no Institute for Genome Research.
Venter fundou a Celera em 1998 com a missão de sequenciar o genoma humano em três anos. Esse objetivo estava em concorrência direta com o Projeto Genoma Humano, que já estava em operação, um consórcio de universidades trabalhando juntas para sequenciar o genoma humano, usando uma estratégia mais antiga chamada sequenciamento baseado em mapa ou BAC para BAC. Esse método envolveu primeiro dividir o genoma em 150.000 peças de pares de bases chamadas BACs, montar os BACs em ordem e depois sequenciar cada BAC em detalhes.
O seqüenciamento de espingarda de genoma inteiro ignora a criação e o mapeamento de BACs e começa com o seqüenciamento de DNA. O processo começa com a aquisição de uma amostra de DNA de alto peso molecular do organismo de interesse e a decomposição física em pedaços pequenos, passando-o por uma seringa de bitola estreita ou sonicando-a, uma maneira de quebrar a amostra usando ondas sonoras. O cisalhamento é um processo aleatório, portanto as seqüências dos fragmentos terão alguma sobreposição entre eles. O cisalhamento não cria especificamente os fragmentos de 2.000 pares de bases necessários para o seqüenciamento, mas fragmentos do tamanho desejado devem ser purificados da mistura.
O próximo passo é unir os fragmentos de DNA ao DNA transportador chamado vetor. Esse processo é conhecido como clonagem e cria uma biblioteca de seqüenciamento a partir da qual a sequência de um genoma inteiro será criada. A sequência de cada clone na biblioteca é determinada e a análise por computador é usada para encontrar sequências sobrepostas ou contínuas em cada fragmento. A montagem das sobreposições cria um "contig", que é um longo trecho contínuo da sequência de DNA.
A clonagem de espingarda geralmente resulta em algumas lacunas entre contigs porque algumas seqüências estão ausentes da biblioteca por acaso. As lacunas podem ser preenchidas criando uma nova biblioteca ou usando seqüências conhecidas para se estender para fora do contig. Como o sequenciamento de espingardas sequencia fragmentos de DNA aleatoriamente, muitos fragmentos são sequenciados mais de uma vez, criando maior certeza de que a sequência está correta do que se cada fragmento tivesse sido sequenciado apenas uma ou duas vezes.
O genoma humano foi sequenciado tanto pelo Projeto Genoma Humano usando sequenciamento baseado em mapas quanto pela Celera usando sequenciamento de espingarda. O sequenciamento de espingarda é agora o método preferido para outros tipos de sequenciamento de genoma. Os genomas completos de muitos organismos, como a planta Arabidopsis thaliana , arroz, vaca, cachorro, galinha, chimpanzé, rato, rato, baiacu e muitos microorganismos foram seqüenciados dessa maneira.