O que é sequenciamento de espingarda?

O sequenciamento

espingarda é um método de seqüenciamento de DNA no qual um longo trecho de DNA é fisicamente quebrado em pequenos (aproximadamente 2.000 pares de base) que são clonados, sequenciados e montados usando análise por computador. Foi desenvolvido e famoso por Craig Venter, da Celera Corporation. Venter desenvolveu a técnica em 1996 enquanto trabalhava no Institute for Genome Research.

Venter fundou Celera em 1998 com a missão de sequenciar o genoma humano dentro de três anos. Esse objetivo estava em concorrência direta com o já operacional Human Genome Project, um consórcio de universidades que trabalham juntas para sequenciar o genoma humano usando uma estratégia mais antiga chamada sequenciamento baseado em mapa ou no BAC-BAC. Esse método envolveu primeiro quebrar o genoma em 150.000 peças de par de bases chamadas BACs, montando os BACs em ordem e depois sequenciando cada BAC em detalhes.O processo começa com a aquisição de uma amostra de DNA de alto peso molecular do organismo de interesse e dividindo fisicamente em pedaços pequenos, passando por uma seringa de bitola estreita ou sonicatando -a, uma maneira de quebrar a amostra usando ondas sonoras. O cisalhamento é um processo aleatório; portanto, as seqüências dos fragmentos terão alguma sobreposição entre eles. O cisalhamento não cria especificamente os 2.000 fragmentos de par de bases necessários para o seqüenciamento, mas os fragmentos do tamanho desejado devem ser purificados da mistura.

O próximo passo é ingressar nos fragmentos de DNA com DNA de transportadora chamado vetor. Esse processo é conhecido como clonagem e cria uma biblioteca de seqüenciamento a partir da qual a sequência de um genoma inteiro será criado. A sequência de cada clone na biblioteca é determinada e a análise do computador é usada para encontrar sequências sobrepostas ou contínuas em cada fragmento. Montando as sobreposições cReatura um "contig", que é um longo trecho contínuo da sequência de DNA.

A clonagem de espingarda geralmente resulta em algumas lacunas entre os contigs porque algumas seqüências estão ausentes da biblioteca por acaso. As lacunas podem ser preenchidas fazendo uma nova biblioteca ou usando sequências conhecidas para se estender para fora do contig. Como os fragmentos de DNA de seqüências de seqüenciamento de espingarda em aleatoriamente, muitos fragmentos são sequenciados mais de uma vez, criando maior certeza de que a sequência está correta do que se cada fragmento tivesse sido sequenciado apenas uma ou duas vezes.

O genoma humano foi sequenciado tanto pelo projeto do genoma humano usando o sequenciamento baseado em mapa quanto por Celera usando o sequenciamento de espingarda. O sequenciamento de espingarda é agora o método preferido para outros tipos de sequenciamento do genoma. Todos os genomas de muitos organismos, como a planta Arabidopsis thaliana , arroz, vaca, cachorro, frango, chimpanzé, rato, rato, bosques de bosques e muitos microorganismos foram sequenciados dessa maneira.