Wat is Shotgun Sequencing?
Shotgun-sequencing is een methode voor DNA-sequencing waarbij een lang stuk DNA fysiek wordt onderverdeeld in kleine fragmenten (ongeveer 2.000 basenparen) die worden gekloond, gesequenced en geassembleerd met behulp van computeranalyse. Het werd ontwikkeld en beroemd gemaakt door Craig Venter van Celera Corporation. Venter ontwikkelde de techniek in 1996 terwijl hij werkte bij het Institute for Genome Research.
Venter richtte Celera in 1998 op met de missie om het menselijk genoom binnen drie jaar te sequencen. Dit doel was in directe competitie met het reeds werkende Human Genome Project, een consortium van universiteiten die samenwerken om het menselijk genoom te sequencen met behulp van een oudere strategie genaamd kaartgebaseerde of BAC-naar-BAC-sequencing. Deze methode omvatte het eerst breken van het genoom in 150.000 basenpaarstukken, BAC's genaamd, de BAC's in volgorde samenstellen en vervolgens elke BAC in detail sequencen.
Hele genoom shotgun-sequencing omzeilt het maken en in kaart brengen van BAC's en begint meteen met DNA-sequencing. Het proces begint met het verkrijgen van een monster van hoogmoleculair DNA van het betreffende organisme en het fysiek in kleine stukjes breken door het door een smalspuit te leiden of het te soniceren, een manier om het monster te breken met behulp van geluidsgolven. Shearing is een willekeurig proces, dus de sequenties van de fragmenten zullen er wat overlap tussen hebben. Shearing creëert niet specifiek de 2.000 basenpaarfragmenten die nodig zijn voor sequentiebepaling, in plaats daarvan moeten fragmenten van de gewenste grootte uit het mengsel worden gezuiverd.
De volgende stap is om de DNA-fragmenten te verbinden met drager-DNA dat een vector wordt genoemd. Dit proces staat bekend als klonen en creëert een sequencing-bibliotheek waaruit de sequentie van een heel genoom wordt gecreëerd. De sequentie van elke kloon in de bibliotheek wordt bepaald en computeranalyse wordt gebruikt om overlappende of continue sequenties in elk fragment te vinden. Het samenvoegen van de overlappingen creëert een "contig", wat een lange doorlopende reeks DNA-sequenties is.
Het klonen van geweren zal meestal resulteren in enkele openingen tussen contigs omdat sommige sequenties toevallig uit de bibliotheek ontbreken. Gaten kunnen worden opgevuld door een nieuwe bibliotheek te maken of door bekende reeksen te gebruiken om naar buiten toe uit te breiden. Omdat willekeurige sequenties van shotgun-sequenties DNA-fragmenten worden, worden veel fragmenten meer dan één keer gesequenced, waardoor meer zekerheid ontstaat dat de sequentie correct is dan wanneer elk fragment slechts één of twee keer was gesequenced.
Het menselijk genoom werd gesequenced door zowel het Human Genome Project met behulp van kaartgebaseerde sequencing als door Celera met shotgun-sequencing. Shotgun-sequencing is nu de voorkeursmethode voor andere soorten genoomsequencing. De volledige genomen van veel organismen, zoals de plant Arabidopsis thaliana , rijst, koe, hond, kip, chimpansee, rat, muis, kogelvis en veel micro-organismen zijn op deze manier gesequenced.