Wat is Shotgun -sequencing?
Shotgun-sequencing is een methode voor DNA-sequencing waarbij een lang stuk DNA fysiek wordt onderverdeeld in kleine (ongeveer 2.000 basispaar) fragmenten die worden gekloond, gesequentieerd en geassembleerd met behulp van computeranalyse. Het werd ontwikkeld en beroemd gemaakt door Craig Venter van Celera Corporation. Venter ontwikkelde de techniek in 1996 tijdens het werk bij het Institute for Genome Research.
Venter richtte Celera op in 1998 met de missie van het sequencen van het menselijke genoom binnen drie jaar. Dit doel was in directe concurrentie met het reeds opererende Human Genome Project, een consortium van universiteiten die samenwerken om het menselijke genoom te sequencen met behulp van een oudere strategie genaamd MAP-gebaseerde of BAC-BAC-sequencing. Deze methode omvatte eerst het genoom in 150.000 basenparen -stukken genaamd BAC's, de BAC's in volgorde assembleren en vervolgens elke BAC in detail sequenceren.
hele genoom shotgun sequencing omzeilt het maken en in kaart brengen van BAC's en begint meteen met DNA -sequencing.Het proces begint met het verkrijgen van een monster van hoog -molecuulgewicht -DNA uit het interessante organisme en het fysiek in kleine stukjes breken door het door een smalspuit te geven of te soniceren, een manier om het monster te breken met geluidsgolven. Shearing is een willekeurig proces, dus de sequenties van de fragmenten hebben een overlapping daartussen. Shearing creëert niet specifiek de 2.000 basenparenfragmenten die nodig zijn voor sequencing, eerder fragmenten van de gewenste grootte moeten worden gezuiverd uit het mengsel.
De volgende stap is om deel te nemen aan de DNA -fragmenten met dragers -DNA dat een vector wordt genoemd. Dit proces staat bekend als klonen en creëert een sequencing -bibliotheek waaruit de volgorde van een heel genoom zal worden gecreëerd. De volgorde van elke kloon in de bibliotheek wordt bepaald en computeranalyse wordt gebruikt om overlappende of continue sequenties in elk fragment te vinden. Monteer de overlappingen CReates een "contig", wat een lang continu stuk DNA -sequentie is.
Shotgun -klonering zal meestal resulteren in enkele openingen tussen contigs omdat sommige sequenties toevallig in de bibliotheek ontbreken. Hiaten kunnen worden opgevuld door een nieuwe bibliotheek te maken of door bekende sequenties te gebruiken om zich naar buiten uit te breiden vanaf de contig. Omdat shotgun sequenties sequenties willekeurig DNA -fragmenten, veel fragmenten meer dan eens worden gesequenced, waardoor meer zekerheid wordt gecreëerd dat de sequentie correct is dan wanneer elk fragment slechts een of twee keer was gesequenced.
Het menselijke genoom werd zowel door het Human Genome Project gesequenced met behulp van Map-Based Sequencing en door Celera met behulp van shotgun-sequencing. Shotgun -sequencing is nu de voorkeursmethode voor andere soorten genoomsequencing. De volledige genomen van vele organismen, zoals de plant Arabidopsis thaliana , rijst, de koe, hond, kip, chimpansee, rat, muis, blackfish en veel micro -organismen zijn op deze manier gesequenced.