Hva er Shotgun Sequencing?

Haglgevarsekvensering er en metode for DNA-sekvensering der en lang DNA-strekk fysisk blir brutt i små (omtrent 2000 basepar) fragmenter som klones, sekvenseres og settes sammen ved hjelp av datamaskinanalyse. Den ble utviklet og gjort kjent av Craig Venter fra Celera Corporation. Venter utviklet teknikken i 1996 mens han arbeidet ved Institute for Genome Research.

Venter grunnla Celera i 1998 med oppdraget om å sekvensere det menneskelige genom innen tre år. Dette målet var i direkte konkurranse med det allerede opererende Human Genome Project, et konsortium av universiteter som jobber sammen for å sekvensere det menneskelige genom ved hjelp av en eldre strategi kalt kartbasert eller BAC-til-BAC-sekvensering. Denne metoden innebar først å bryte genomet i 150 000 baseparpar som ble kalt BAC, montering av BAC i rekkefølge og deretter sekvensering av hver BAC i detalj.

Hele genom haglesekvenssekvensering omgår skapelsen og kartleggingen av BAC-er og starter rett inn med DNA-sekvensering. Prosessen starter med å anskaffe en prøve med høy molekylvekt DNA fra organismen av interesse og fysisk bryte den i små biter ved å føre den gjennom en smal målesprøyte eller lydbehandle den, en måte å bryte prøven ved å bruke lydbølger. Skjæring er en tilfeldig prosess, så sekvensene av fragmentene vil ha en viss overlapping mellom seg. Skjæring skaper ikke spesifikt de 2.000 baseparfragmentene som er nødvendige for sekvensering, snarere fragmenter av ønsket størrelse må renses fra blandingen.

Det neste trinnet er å gå sammen med DNA-fragmentene med bærer-DNA som kalles en vektor. Denne prosessen er kjent som kloning, og den lager et sekvenseringsbibliotek som sekvensen til et helt genom vil opprette. Sekvensen til hver klon i biblioteket bestemmes, og datamaskinanalyse brukes til å finne overlappende eller kontinuerlige sekvenser i hvert fragment. Å sette sammen overlappene skaper en "contig", som er en lang kontinuerlig strekning av DNA-sekvens.

Kloning av hagle vil vanligvis føre til at det er noen gap mellom kontigenter fordi noen sekvenser mangler fra biblioteket ved en tilfeldighet. Mellomrom kan fylles ved å lage et nytt bibliotek eller ved å bruke kjente sekvenser for å strekke seg utover fra kontigen. Fordi haglgeværsekvenssekvenser DNA-fragmenter tilfeldig, blir mange fragmenter sekvensert mer enn en gang, noe som skaper større sikkerhet for at sekvensen er riktig enn om hvert fragment bare hadde blitt sekvensert en eller to ganger.

Det menneskelige genom ble sekvensert både av Human Genome Project ved hjelp av kartbasert sekvensering og av Celera ved bruk av haglesekvensering. Haglgevarsekvensering er nå den foretrukne metoden for andre typer genomsekvensering. De fulle genomene til mange organismer, for eksempel planten Arabidopsis thaliana , ris, kua, hunden, kyllingen, sjimpansen, rotta, mus, pufferfisk og mange mikroorganismer er blitt sekvensert på denne måten.