Co to jest sekwencjonowanie strzelby?

Sekwencjonowanie strzelby jest metodą sekwencjonowania DNA, w której długi odcinek DNA jest fizycznie podzielony na małe (około 2000 par bazowych), które są sklonowane, sekwencjonowane i montowane przy użyciu analizy komputerowej. Został opracowany i rozsławiony przez Craig Venter z Celera Corporation. Venter opracował technikę w 1996 r. Podczas pracy w Institute for Genome Research.

Venter założył Celera w 1998 roku z misją sekwencjonowania ludzkiego genomu w ciągu trzech lat. Ten cel był w bezpośrednim konkurowaniu z już działającym projektem genomu ludzkiego, konsorcjum uniwersytetów współpracujących w celu sekwencjonowania ludzkiego genomu przy użyciu starszej strategii zwanej sekwencjonowaniem opartym na mapie lub BAC-BAC. Metoda ta polegała na najpierw rozbiciu genomu na 150 000 elementów par zasad zwanych BACS, złożenie BAC w kolejności, a następnie szczegółowo sekwencjonowanie BAC.

Sekwencjonowanie strzelb całego genomu omija tworzenie i mapowanie BAC i zaczyna się od sekwencjonowania DNA.Proces rozpoczyna się od uzyskania próbki DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z organizmu zainteresowania i fizycznego rozbicia go na małe kawałki, przepuszczając ją przez strzykawkę wąskopiętrową lub sonizując, sposób na złamanie próbki za pomocą fal dźwiękowych. Tymianie jest losowym procesem, więc sekwencje fragmentów będą miały pewne nakładanie się między nimi. Tymianie nie tworzy specyficznie 2000 fragmentów pary zasad potrzebnych do sekwencjonowania, raczej fragmenty pożądanego rozmiaru muszą być oczyszczone z mieszaniny.

Kolejnym krokiem jest dołączenie do fragmentów DNA z DNA nośnika zwanego wektorem. Proces ten jest znany jako klonowanie i tworzy bibliotekę sekwencjonowania, z której powstanie sekwencja całego genomu. Sekwencja każdego klonu w bibliotece jest określana, a analiza komputerowa jest używana do znalezienia nakładania się lub ciągłych sekwencji w każdym fragmencie. Montaż nakładania się creaguje „kontig”, który jest długim ciągłym odcinkiem sekwencji DNA.

Klonowanie strzelby zwykle powoduje pewne przerwy między kontigami, ponieważ przypadkowo brakuje niektórych sekwencji. Luki można wypełnić, tworząc nową bibliotekę lub używając znanych sekwencji, aby rozciągnąć się na zewnątrz od kontigu. Ponieważ sekwencje sekwencjonowania strzelb fragmenty DNA z losowo, wiele fragmentów jest sekwencjonowanych więcej niż jeden raz, powodując większą pewność, że sekwencja jest poprawna niż w przypadku zsekwencjonowania tylko raz lub dwa razy.

Human genom został zsekwencjonowany zarówno przez ludzki projekt genomu przy użyciu sekwencjonowania opartego na mapie, jak i przez Celera za pomocą sekwencjonowania strzelby. Sekwencjonowanie strzelby jest teraz preferowaną metodą dla innych rodzajów sekwencjonowania genomu. Pełne genomy wielu organizmów, takie jak roślina Arabidopsis thaliana , ryż, krowa, pies, kurczak, szympansa, szczur, mysz, pędnicy i wiele mikroorganizmów zostały zsekwencjonowane w ten sposób.