Co to jest sekwencjonowanie strzelby?
Sekwencjonowanie strzelby to metoda sekwencjonowania DNA, w której długi odcinek DNA jest fizycznie dzielony na małe fragmenty (około 2000 par zasad), które są klonowane, sekwencjonowane i składane za pomocą analizy komputerowej. Został opracowany i rozsławiony przez Craiga Ventera z Celera Corporation. Venter opracował tę technikę w 1996 r., Pracując w Institute for Genome Research.
Venter założył Celera w 1998 roku z misją sekwencjonowania ludzkiego genomu w ciągu trzech lat. Cel ten był bezpośrednią konkurencją dla działającego już Human Genome Project, konsorcjum uniwersytetów współpracujących nad sekwencjonowaniem ludzkiego genomu przy użyciu starszej strategii zwanej sekwencjonowaniem opartym na mapie lub BAC-do-BAC. Ta metoda obejmowała najpierw rozbicie genomu na 150 000 par zasad, zwanych BAC, składanie BAC w kolejności, a następnie szczegółowe sekwencjonowanie każdego BAC.
Sekwencjonowanie strzelby w całym genomie omija tworzenie i mapowanie BAC i rozpoczyna się od sekwencjonowania DNA. Proces rozpoczyna się od pobrania próbki DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z organizmu, który jest przedmiotem zainteresowania, i fizycznego rozbicia go na małe kawałki poprzez przepuszczenie go przez strzykawkę o wąskim rozstawie lub sonikację, co jest sposobem na rozbicie próbki za pomocą fal dźwiękowych. Ścinanie jest procesem losowym, więc sekwencje fragmentów będą się między sobą nakładać. Ścinanie nie tworzy specjalnie fragmentów 2000 par zasad potrzebnych do sekwencjonowania, a raczej fragmenty o pożądanej wielkości muszą być oczyszczone z mieszaniny.
Następnym krokiem jest połączenie fragmentów DNA z nośnym DNA zwanym wektorem. Proces ten nazywany jest klonowaniem i tworzy bibliotekę do sekwencjonowania, z której utworzona zostanie sekwencja całego genomu. Określana jest sekwencja każdego klonu w bibliotece, a analiza komputerowa służy do znalezienia nakładających się lub ciągłych sekwencji w każdym fragmencie. Złożenie nakładek tworzy „kontig”, który jest długim ciągłym odcinkiem sekwencji DNA.
Klonowanie strzelby zwykle powoduje pewne przerwy między kontigami, ponieważ przypadkiem brakuje niektórych sekwencji z biblioteki. Luki można uzupełnić, tworząc nową bibliotekę lub wykorzystując znane sekwencje do wyciągnięcia na zewnątrz z kontigu. Ponieważ sekwencjonowanie sekwencji strzelbowych fragmenty DNA są losowe, wiele fragmentów sekwencjonuje się więcej niż jeden raz, co daje większą pewność, że sekwencja jest poprawna, niż gdyby każdy fragment został zsekwencjonowany tylko raz lub dwa razy.
Ludzki genom został zsekwencjonowany zarówno przez Human Genome Project przy użyciu sekwencjonowania opartego na mapie, jak i przez Celera przy użyciu sekwencjonowania strzelby. Sekwencjonowanie strzelby jest obecnie preferowaną metodą dla innych rodzajów sekwencjonowania genomu. W ten sposób zsekwencjonowano pełne genomy wielu organizmów, takich jak roślina Arabidopsis thaliana , ryż, krowa, pies, kurczak, szympans, szczur, mysz, pufferfish i wiele mikroorganizmów.