¿Qué es la secuenciación de escopeta?
La secuenciación de la escopeta
es un método de secuenciación de ADN mediante el cual un largo tramo de ADN se divide físicamente en pequeños fragmentos (aproximadamente 2,000 pares de bases) que se clonan, secuencian y ensamblan usando análisis de computadora. Fue desarrollado y hecho famoso por Craig Venter de Celera Corporation. Venter desarrolló la técnica en 1996 mientras trabajaba en el Instituto de Investigación del Genoma.
Venter fundó Celera en 1998 con la misión de secuenciar el genoma humano en tres años. Este objetivo era una competencia directa con el proyecto del genoma humano ya operativo, un consorcio de universidades que trabajan juntas para secuenciar el genoma humano utilizando una estrategia más antigua llamada secuenciación basada en mapas o BAC a BAC. Este método implicó primero romper el genoma en 150,000 piezas de pares de bases llamadas BAC, ensamblar los BAC en orden y luego secuenciar cada BAC en detalle.
La secuenciación de escopeta completa del genoma omite la creación y el mapeo de BAC y comienza con la secuenciación de ADN.El proceso comienza con la adquisición de una muestra de ADN de alto peso molecular del organismo de interés y la interrumpe físicamente en piezas pequeñas pasándolo a través de una jeringa de mancha estrecha o sonicura, una forma de romper la muestra con ondas de sonido. El corte es un proceso aleatorio, por lo que las secuencias de los fragmentos tendrán cierta superposición entre ellos. El corte no crea específicamente los 2.000 fragmentos de pares de bases necesarios para la secuenciación, más bien los fragmentos del tamaño deseado deben purificarse de la mezcla.
El siguiente paso es unir los fragmentos de ADN con ADN portador llamado vector. Este proceso se conoce como clonación, y crea una biblioteca de secuenciación a partir de la cual se creará la secuencia de un genoma completo. Se determina la secuencia de cada clon en la biblioteca, y el análisis por computadora se usa para encontrar secuencias superpuestas o continuas en cada fragmento. Ensamblar las superposiciones cRealiza un "contig", que es un largo estiramiento continuo de secuencia de ADN.
La clonaciónde escopeta generalmente dará como resultado algunos espacios entre contigs porque faltan algunas secuencias en la biblioteca por casualidad. Los espacios se pueden llenar haciendo una nueva biblioteca o utilizando secuencias conocidas para extenderse hacia afuera desde el contig. Debido a que las secuencias de secuenciación de escopeta fragmentos de ADN al azar, muchos fragmentos se secuencian más de una vez, creando una mayor certeza de que la secuencia es correcta que si cada fragmento solo se hubiera secuenciado una o dos veces.
El genoma humano fue secuenciado tanto por el proyecto del genoma humano utilizando secuenciación basada en mapas como por celera usando secuenciación de escopeta. La secuenciación de escopeta es ahora el método preferido para otros tipos de secuenciación del genoma. Los genomas completos de muchos organismos, como la planta Arabidopsis thaliana , arroz, vaca, perro, pollo, chimpancé, rata, ratón, pez globo y muchos microorganismos han sido secuenciados de esta manera.