Hva er en polymerase kjedereaksjon?
Polymerasekjedereaksjonen (PCR) bruker enzymer for å masse replikere en del av en deoksyribonukleinsyre (DNA) -streng for enklere analyse, for eksempel å søke etter gener av interesse. I likhet med kjernekjedereaksjonen er polymerasekjedereaksjonen en eksponentiell prosess som fortsetter så lenge råvarene for å opprettholde reaksjonen er tilgjengelige. I motsetning til DNA-replikasjon i den naturlige verden, kan polymerasekjedereaksjonen bare gjenskape ganske små DNA-biter, med et øvre tak på omtrent 2-3 kilo basepar (kb). En polymerasekjedereaksjon bruker livløse enzymer for å oppnå replikasjonseffekten, og skiller den fra andre kopieringsmetoder som bruker aktive organismer.
En moderne polymerasekjedereaksjon krever seks basiske komponenter for å fungere: DNA-segmentet som skal kopieres, primere for å avgrense segmentet, Taq-polymerase for å gjøre kopiering, DNA-nukleotider for å tjene som råstoff, et kjemisk buffermiljø og en maskin som kalles en termisk cycler. Den termiske sykleren rommer ofte flere prøverør med flere polymerasekjedereaksjoner, som hver har 15 til 100 mikroliter, verdier i underkant av en kubikk millimeter vann. Om lag hundre nanogram DNA-base brukes.
Taq-polymerase, nøkkelingrediensen for en polymerasekjedereaksjon, trekkes ut fra en dypt hav, termisk ventilasjonsbakterie, Thermus aquaticus . Det fungerer bra for kopiering, men ikke perfekt, og gjør en feil omtrent hver 8 million basepar. Før Taq-polymerase ble andre polymeraser brukt, men mange av dem brøt sammen ved de nødvendige temperaturer for at reaksjonen skulle begynne. Oppvarmingssyklusen er komplisert, men inkluderer temperaturer som strekker seg nesten helt til kokepunktet, så holdbarheten i polymerasen er viktig.
De grunnleggende trinnene for polymerasekjedereaksjonen er som følger. Alle ingrediensene blandes sammen i et lite hetteglass, vanligvis med et volum på 200 mikrogram. Blandingen blir oppvarmet til nær kokepunkt for å bryte hydrogenbindelsene i det parstrengede DNA, og skaper enkeltstrenger som er mottakelige for kopiering. Dette kalles denaturering . Jo lengre strengen som skal kopieres, jo lenger varer denatureringsprosessen.
Det neste trinnet i polymerasekjedereaksjonen kalles annealing . Primerne, som er skreddersydde, korte DNA-tråder, er designet spesielt for å binde seg til steder i begynnelsen og slutten av segmentet som skal kopieres. Hvis grunningene er feil utformet eller temperaturen på dette stadiet er feil, vil primeren binde tilfeldig til DNA, noe som resulterer i feil segmentkopi. De fleste grunningsmelter smelter omtrent to tredjedeler av veien til kokepunktet, og utglødningen, en 1-2 minutters prosess, foregår noen få grader under dette.
De siste trinnene i polymerasekjedereaksjonen kalles ekstensjon og endelig utvidelse . Det er her magien skjer. Polymerasen kopierer DNA-segmentet raskt, og skaper millioner og millioner av eksemplarer på få minutter. Vanligvis består en syklus av alle de foregående trinn, gjentatt omtrent tjue eller tretti ganger.
Resultatet er en haug med kopiert DNA. Polymerasekjedereaksjoner har en rekke bruksområder, inkludert farskapstesting, bestemme tilstedeværelse eller fravær av en genetisk defekt eller virus-DNA, kloning av et gen, innføring av spesifikke mutasjoner, analyse av DNA fra utdødde arter eller døde personer, "genetisk fingeravtrykk" ved kriminalitet, og mer.