Vad är en polymeraskedjereaktion?
Polymeraskedjereaktionen (PCR) använder enzymer för att massa replikera en del av en deoxiribonukleinsyra (DNA) -sträng för enklare analys, till exempel att söka efter gener av intresse. Liksom kärnkraftsreaktionen är polymeraskedjereaktionen en exponentiell process som fortsätter så länge råmaterialen för att upprätthålla reaktionen är tillgängliga. Till skillnad från DNA-replikering i den naturliga världen, kan polymeraskedjereaktionen bara replikera ganska små DNA-bitar, med ett övre tak på cirka 2-3 kilo baspar (kb). En polymeraskedjereaktion använder livlösa enzymer för att åstadkomma dess replikationseffekt och skiljer den från andra kopieringsmetoder som använder aktiva organismer.
En modern polymeraskedjereaktion kräver sex grundläggande komponenter för att fungera: DNA-segmentet som ska kopieras, primrar för att avgränsa segmentet, Taq-polymeras för att göra kopiering, DNA-nukleotider för att tjäna som råmaterial, en kemisk buffertmiljö och en maskin som kallas en termisk cykelapparat. Den termiska cykeln håller ofta flera provrör med flera polymeraskedjereaktioner, var och en innehar 15 till 100 mikroliter, värden strax under en kubik millimeter vatten. Cirka hundra nanogram DNA-bas används.
Taq-polymeras, den viktigaste ingrediensen för en polymeraskedjereaktion, extraheras från en djuphavs, termisk ventileringsbakterie, Thermus aquaticus . Det fungerar bra för att kopiera, men inte perfekt, och göra ett fel ungefär en gång var 8 miljon baspar. Innan Taq-polymeras användes andra polymeraser, men många av dem bröt ner vid de nödvändiga temperaturerna för att reaktionen skulle börja. Uppvärmningscykeln är komplicerad, men inkluderar temperaturer som sträcker sig nästan hela tiden till kokpunkten, så hållbarhet i polymeraset är avgörande.
De grundläggande stegen för polymeraskedjereaktionen är som följer. Alla ingredienser blandas i ett litet injektionsflaska, vanligtvis med en volym av 200 mikrogram. Blandningen upphettas till nära kokpunkt för att bryta vätebindningarna i det parsträngade DNA, vilket skapar enstaka strängar som är mottagliga för kopiering. Detta kallas denaturering . Ju längre sträng som ska kopieras, desto längre håller denatureringsprocessen.
Nästa steg i polymeraskedjereaktionen kallas glödgning . Primrarna, som är skräddarsydda, korta DNA-strängar, är utformade specifikt för att binda till platser i början och slutet av det segment som ska kopieras. Om primrarna är felaktigt utformade eller temperaturen i detta skede är fel kommer primern att binda slumpmässigt till DNA, vilket resulterar i fel segmentkopiering. De flesta primers smälter ungefär två tredjedelar av vägen till kokpunkten, och glödgningen, en 1-2 minuters process, äger rum vid några grader under detta.
De sista stegen i polymeraskedjereaktionen kallas förlängning och slutlig förlängning . Det är här magin händer. Polymeraset kopierar DNA-segmentet snabbt och skapar miljoner och miljoner kopior på bara några minuter. Vanligtvis består en cykel av alla tidigare steg, upprepade cirka tjugo eller trettio gånger.
Resultatet är ett gäng kopierat DNA. Polymeraskedjereaktioner har olika användningsområden, inklusive faderskapstestning, bestämning av närvaro eller frånvaro av en genetisk defekt eller viralt DNA, kloning av en gen, införande av specifika mutationer, analys av DNA från utrotade arter eller döda personer, "genetiskt fingeravtryck" vid brottsplats och mer.