Che cos'è una reazione a catena della polimerasi?
La reazione a catena della polimerasi (PCR) utilizza enzimi per replicare in massa una porzione di un filamento di acido desossiribonucleico (DNA) per un'analisi più semplice, come la ricerca di geni di interesse. Come la reazione a catena nucleare, la reazione a catena della polimerasi è un processo esponenziale che procede fintanto che sono disponibili le materie prime per sostenere la reazione. Contrariamente alla replicazione del DNA nel mondo naturale, la reazione a catena della polimerasi può replicare solo frammenti di DNA abbastanza piccoli, con un soffitto superiore di circa 2-3 kg di coppie di basi (kb). Una reazione a catena della polimerasi utilizza enzimi inanimati per ottenere il suo effetto di replicazione, distinguendolo dagli altri approcci di copiatura che utilizzano organismi attivi.
Una moderna reazione a catena della polimerasi richiede sei componenti di base per funzionare: il segmento di DNA da copiare, i primer per delimitare il segmento, la Taq polimerasi per eseguire la copia, i nucleotidi di DNA da utilizzare come materia prima, un ambiente di buffer chimico e una macchina chiamata termica cycler. Il termociclatore spesso contiene più provette con più reazioni a catena della polimerasi, ciascuna contenente da 15 a 100 microlitri, valori appena al di sotto di un millimetro cubo di acqua. Vengono utilizzati circa cento nanogrammi di base di DNA.
La Taq polimerasi, l'ingrediente chiave per una reazione a catena della polimerasi, viene estratta da un batterio di acque profonde che abita nello sfiato termico, Thermus aquaticus . Funziona bene per la copia, ma non perfettamente, facendo un errore circa una volta ogni 8 milioni di coppie di basi. Prima della Taq polimerasi, venivano utilizzate altre polimerasi, ma molte di esse si disgregavano alle temperature necessarie per iniziare la reazione. Il ciclo di riscaldamento è complicato, ma include temperature che variano brevemente fino quasi al punto di ebollizione, quindi la durabilità nella polimerasi è essenziale.
I passaggi di base della reazione a catena della polimerasi sono i seguenti. Tutti gli ingredienti sono mescolati insieme in una piccola fiala, di solito con un volume di 200 microgrammi. La miscela viene riscaldata fino al punto di ebollizione per rompere i legami idrogeno nel DNA a filamenti di coppia, creando singoli filamenti suscettibili alla copia. Questo si chiama denaturazione . Più è lungo il filo da copiare, più dura il processo di denaturazione.
Il passo successivo nella reazione a catena della polimerasi è chiamato ricottura . I primer, che sono filamenti di DNA corti su misura, sono progettati specificamente per legarsi ai siti all'inizio e alla fine del segmento da copiare. Se i primer sono progettati in modo errato o la temperatura in questa fase è errata, il primer si legherà casualmente al DNA, risultando nella copia del segmento sbagliata. La maggior parte dei primer si scioglie a circa due terzi del punto di ebollizione e la ricottura, un processo di 1-2 minuti, avviene a pochi gradi al di sotto di questo.
Gli ultimi passaggi della reazione a catena della polimerasi sono chiamati estensione ed estensione finale . Qui è dove avviene la magia. La polimerasi copia rapidamente il segmento del DNA, creando milioni e milioni di copie in pochi minuti. Di solito, un ciclo è costituito da tutti i passaggi precedenti, ripetuti circa venti o trenta volte.
Il risultato è un mucchio di DNA copiato. Le reazioni a catena della polimerasi hanno una varietà di usi, tra cui test di paternità, determinazione della presenza o assenza di un difetto genetico o del DNA virale, clonazione di un gene, introduzione di mutazioni specifiche, analisi del DNA di specie estinte o persone morte, "fingerprinting genetico" presso scena del crimine e altro ancora.