Co to jest reakcja łańcuchowa polimerazy?
Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) wykorzystuje enzymy do masowej replikacji części nici kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) w celu łatwiejszej analizy, takiej jak wyszukiwanie interesujących genów. Podobnie jak nuklearna reakcja łańcuchowa, reakcja łańcuchowa polimerazy jest procesem wykładniczym, który zachodzi tak długo, jak długo dostępne są surowce do podtrzymania reakcji. W przeciwieństwie do replikacji DNA w świecie przyrody, reakcja łańcuchowa polimerazy może replikować tylko dość małe fragmenty DNA, z górnym pułapem wynoszącym około 2-3 kg par zasad (kb). Reakcja łańcuchowa polimerazy wykorzystuje enzymy nieożywione, aby osiągnąć efekt replikacji, co odróżnia ją od innych metod kopiowania wykorzystujących organizmy aktywne.
Współczesna reakcja łańcuchowa polimerazy wymaga sześciu podstawowych składników do działania: segmentu DNA do skopiowania, starterów do ograniczenia segmentu, polimerazy Taq do kopiowania, nukleotydów DNA jako surowca, bufora chemicznego i maszyny zwanej termiczną rowerzysta. Termocykler często przechowuje wiele probówek z wieloma reakcjami łańcuchowymi polimerazy, każda o pojemności od 15 do 100 mikrolitrów, o wartości tuż poniżej milimetra sześciennego wody. Zużywa się około stu nanogramów zasady DNA.
Polimeraza Taq, kluczowy składnik reakcji łańcuchowej polimerazy, jest ekstrahowana z głębinowych bakterii termicznych zamieszkujących ujścia, Thermus aquaticus . Działa dobrze do kopiowania, ale nie idealnie, popełniając błąd raz na 8 milionów par zasad. Przed polimerazą Taq stosowano inne polimerazy, ale wiele z nich uległo rozkładowi w temperaturach koniecznych do rozpoczęcia reakcji. Cykl ogrzewania jest skomplikowany, ale obejmuje krótkotrwałe temperatury sięgające prawie do temperatury wrzenia, więc trwałość polimerazy jest niezbędna.
Podstawowe etapy reakcji łańcuchowej polimerazy są następujące. Wszystkie składniki miesza się razem w małej fiolce, zwykle o objętości 200 mikrogramów. Mieszaninę ogrzewa się do temperatury zbliżonej do wrzenia, aby zerwać wiązania wodorowe w dwuniciowym DNA, tworząc pojedyncze nici podatne na kopiowanie. Nazywa się to denaturacją . Im dłuższe jest pasmo do skopiowania, tym dłużej trwa proces denaturacji.
Kolejny etap reakcji łańcuchowej polimerazy nazywa się wyżarzaniem . Startery, które są niestandardowymi, krótkimi nićmi DNA, są zaprojektowane specjalnie do wiązania się z miejscami na początku i na końcu segmentu, który ma zostać skopiowany. Jeśli startery są niepoprawnie zaprojektowane lub temperatura na tym etapie jest nieprawidłowa, starter wiąże się losowo z DNA, co powoduje powstanie niewłaściwej kopii segmentu. Większość starterów topi się na około dwie trzecie drogi do temperatury wrzenia, a wyżarzanie, proces trwający 1–2 minuty, odbywa się o kilka stopni poniżej tej temperatury.
Ostatnie etapy reakcji łańcuchowej polimerazy nazywane są wydłużaniem i końcowym wydłużaniem . Tutaj dzieje się magia. Polimeraza szybko kopiuje segment DNA, tworząc miliony kopii w kilka minut. Zwykle cykl składa się ze wszystkich poprzednich kroków, powtarzanych około dwadzieścia lub trzydzieści razy.
Rezultatem jest wiązka skopiowanego DNA. Reakcje łańcuchowe polimerazy mają wiele zastosowań, w tym badanie ojcostwa, określanie obecności lub braku defektu genetycznego lub wirusowego DNA, klonowanie genu, wprowadzanie określonych mutacji, analiza DNA wymarłych gatunków lub martwych osób, „genetyczny odcisk palca” na miejsce zbrodni i nie tylko.