Was ist eine Polymerasekettenreaktion?
Die Polymerasekettenreaktion (PCR) verwendet Enzyme, um einen Teil eines Desoxyribonukleinsäure- (DNA-) Strangs für eine einfachere Analyse, wie zum Beispiel die Suche nach interessierenden Genen, in der Masse zu replizieren. Wie die Kernkettenreaktion ist die Polymerasekettenreaktion ein exponentieller Prozess, der abläuft, solange die Rohstoffe zur Aufrechterhaltung der Reaktion verfügbar sind. Im Gegensatz zur DNA-Replikation in der Natur kann die Polymerasekettenreaktion nur relativ kleine DNA-Stücke mit einer Obergrenze von etwa 2-3 Kilobasenpaaren (kb) replizieren. Eine Polymerasekettenreaktion verwendet unbelebte Enzyme, um ihren Replikationseffekt zu erzielen, und unterscheidet sie von anderen Kopieransätzen, bei denen aktive Organismen verwendet werden.
Für eine moderne Polymerasekettenreaktion sind sechs Grundkomponenten erforderlich: das zu kopierende DNA-Segment, Primer zur Abgrenzung des Segments, Taq-Polymerase zum Kopieren, DNA-Nukleotide als Ausgangsmaterial, eine chemische Pufferumgebung und eine Maschine, die als thermisch bezeichnet wird Radfahrer. Der Thermocycler fasst häufig mehrere Reagenzgläser mit mehreren Polymerasekettenreaktionen mit jeweils 15 bis 100 Mikrolitern, Werte knapp unter einem Kubikmillimeter Wasser. Etwa hundert Nanogramm DNA-Base werden verwendet.
Die Taq-Polymerase, der Schlüsselbestandteil für eine Polymerasekettenreaktion, wird aus einem Tiefseebakterium, Thermus aquaticus , extrahiert. Es funktioniert gut zum Kopieren, ist aber nicht perfekt und macht etwa alle 8 Millionen Basenpaare einen Fehler. Vor der Taq-Polymerase wurden andere Polymerasen verwendet, von denen jedoch viele bei den für den Beginn der Reaktion erforderlichen Temperaturen abgebaut wurden. Der Erhitzungszyklus ist kompliziert, schließt jedoch Temperaturen ein, die kurzzeitig fast bis zum Siedepunkt reichen, so dass die Beständigkeit der Polymerase wesentlich ist.
Die Grundschritte der Polymerasekettenreaktion sind wie folgt. Alle Zutaten werden in einer kleinen Durchstechflasche zusammengemischt, normalerweise mit einem Volumen von 200 Mikrogramm. Das Gemisch wird bis nahe an den Siedepunkt erhitzt, um die Wasserstoffbrückenbindungen in der paarsträngigen DNA aufzubrechen, wodurch Einzelstränge entstehen, die kopiert werden können. Dies nennt man Denaturierung . Je länger der zu kopierende Strang ist, desto länger dauert der Denaturierungsprozess.
Der nächste Schritt in der Polymerasekettenreaktion wird als Tempern bezeichnet . Die Primer, bei denen es sich um maßgeschneiderte kurze DNA-Stränge handelt, sind speziell für die Bindung an Stellen am Anfang und Ende des zu kopierenden Segments konzipiert. Wenn die Primer falsch konstruiert sind oder die Temperatur in diesem Stadium falsch ist, bindet der Primer zufällig an die DNA, was zu einer falschen Segmentkopie führt. Die meisten Primer schmelzen bei etwa zwei Dritteln des Siedepunkts, und ein Tempern, ein 1-2-minütiger Vorgang, findet einige Grad darunter statt.
Die letzten Schritte in der Polymerasekettenreaktion werden Verlängerung und Endverlängerung genannt . Hier geschieht die Magie. Die Polymerase kopiert das DNA-Segment schnell und erstellt Millionen und Abermillionen Kopien in nur wenigen Minuten. Normalerweise besteht ein Zyklus aus allen vorherigen Schritten, die etwa zwanzig- oder dreissigmal wiederholt werden.
Das Ergebnis ist eine Menge kopierter DNA. Polymerasekettenreaktionen können vielfältig eingesetzt werden, einschließlich Vaterschaftstests, Feststellung des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins eines genetischen Defekts oder einer viralen DNA, Klonierung eines Gens, Einführung spezifischer Mutationen, Analyse der DNA ausgestorbener Arten oder toter Personen, "genetischer Fingerabdruck" am Tatort und mehr.