Hvad er en polymerasekædereaktion?
Polymerasekædereaktionen (PCR) bruger enzymer til masse-replikation af en del af en deoxyribonukleinsyre (DNA) -streng til lettere analyse, såsom at søge efter gener af interesse. Ligesom den nukleare kædereaktion er polymerasekædereaktionen en eksponentiel proces, der fortsætter, så længe råmaterialerne til opretholdelse af reaktionen er tilgængelige. I modsætning til DNA-replikation i den naturlige verden kan polymerasekædereaktionen kun replikere ret små dele af DNA med et øverste loft på ca. 2-3 kg basepar (kb). En polymerasekædereaktion anvender livlige enzymer til at opnå dens replikationseffekt, idet den adskilles fra andre kopieringsmetoder, der bruger aktive organismer.
En moderne polymerasekædereaktion kræver seks basiske komponenter for at arbejde: DNA-segmentet, der skal kopieres, primere til at afgrænse segmentet, Taq-polymerase for at udføre kopiering, DNA-nukleotider til at tjene som råmateriale, et kemisk puffermiljø og en maskine kaldet en termisk cycler. Den termiske cykler holder ofte flere reagensglas med flere polymerasekædereaktioner, der hver har 15 til 100 mikroliter, værdier lige under en kubik millimeter vand. Cirka hundrede nanogram DNA-base anvendes.
Taq-polymerase, nøgleingrediensen til en polymerasekædereaktion, ekstraheres fra en dybhavs, termisk udluftnings-bakterie, Thermus aquaticus . Det fungerer godt til kopiering, men ikke perfekt, ved at lave en fejl omkring hver 8 million basepar. Før Taq-polymerase blev andre polymeraser anvendt, men mange af dem brød sammen ved de nødvendige temperaturer for reaktionen at begynde. Opvarmningscyklussen er kompliceret, men inkluderer temperaturer, der kortvarigt spænder næsten helt til kogepunktet, så holdbarhed i polymerasen er afgørende.
De grundlæggende trin i polymerasekædereaktionen er som følger. Alle ingredienser blandes sammen i et lille hætteglas, normalt med et volumen på 200 mikrogram. Blandingen opvarmes til næsten kogepunkt for at bryde hydrogenbindingerne i det parstrengede DNA, hvilket skaber enkeltstrenge, der er modtagelige for kopiering. Dette kaldes denaturering . Jo længere strengen der skal kopieres, jo længere varer denatureringsprocessen.
Det næste trin i polymerasekædereaktionen kaldes annealing . Primerne, der er specialfremstillede, korte DNA-strenge, er designet specifikt til at binde til steder i begyndelsen og slutningen af det segment, der skal kopieres. Hvis primerne er forkert designet, eller temperaturen på dette trin er forkert, binder primeren tilfældigt til DNA'et, hvilket resulterer i den forkerte segmentkopi. De fleste primere smelter omkring to tredjedele af vejen til kogepunktet, og udglødning, en 1-2 minutters proces, finder sted et par grader under dette.
De sidste trin i polymerasekædereaktionen kaldes ekstension og endelig ekstension . Det er her magien sker. Polymerasen kopierer DNA-segmentet hurtigt og skaber millioner og millioner af kopier på få minutter. Normalt består en cyklus af alle de foregående trin, gentaget ca. tyve eller tredive gange.
Resultatet er en flok kopieret DNA. Polymerasekædereaktioner har forskellige anvendelser, herunder faderskabstestning, bestemmelse af tilstedeværelsen eller fraværet af en genetisk defekt eller viral DNA, kloning af et gen, introduktion af specifikke mutationer, analyse af DNA fra uddøde arter eller døde personer, "genetisk fingeraftryk" ved kriminalscene med mere.