O que é uma reação em cadeia da polimerase?

A reação em cadeia da polimerase (PCR) utiliza enzimas para replicar em massa uma porção de uma cadeia de ácido desoxirribonucleico (DNA) para facilitar a análise, como a busca por genes de interesse. Como a reação em cadeia nuclear, a reação em cadeia da polimerase é um processo exponencial que prossegue enquanto as matérias-primas para sustentar a reação estiverem disponíveis. Em contraste com a replicação de DNA no mundo natural, a reação em cadeia da polimerase só pode replicar pedaços bastante pequenos de DNA, com um teto superior de cerca de 2-3 quilos de pares de bases (kb). Uma reação em cadeia da polimerase usa enzimas inanimadas para realizar seu efeito de replicação, diferenciando-a de outras abordagens de cópia que usam organismos ativos.

Uma reação em cadeia da polimerase moderna requer seis componentes básicos para funcionar: o segmento de DNA a ser copiado, os primers para delimitar o segmento, a polimerase Taq para fazer a cópia, os nucleotídeos de DNA para servir como matéria-prima, um ambiente de tampão químico e uma máquina chamada térmica ciclador. O termociclador costuma conter vários tubos de ensaio com várias reações em cadeia da polimerase, cada uma contendo 15 a 100 microlitros, valores abaixo de um milímetro cúbico de água. São utilizados cerca de cem nanogramas de base de DNA.

A polimerase Taq, o principal ingrediente para uma reação em cadeia da polimerase, é extraída de uma bactéria do fundo do mar, Thermus aquaticus . Funciona bem para copiar, mas não perfeitamente, cometendo um erro aproximadamente uma vez a cada 8 milhões de pares de bases. Antes da polimerase Taq, outras polimerases eram usadas, mas muitas delas se decompuseram nas temperaturas necessárias para o início da reação. O ciclo de aquecimento é complicado, mas inclui temperaturas que variam brevemente até quase o ponto de ebulição, portanto, a durabilidade na polimerase é essencial.

Os passos básicos da reação em cadeia da polimerase são os seguintes. Todos os ingredientes são misturados em um frasco pequeno, geralmente com um volume de 200 microgramas. A mistura é aquecida próximo ao ponto de ebulição para quebrar as ligações de hidrogênio no DNA de dupla fita, criando fitas simples que são suscetíveis de cópia. Isso é chamado de desnaturação . Quanto mais tempo o fio a ser copiado, mais longo o processo de desnaturação.

O próximo passo na reação em cadeia da polimerase é chamado de recozimento . Os primers, que são cadeias curtas de DNA personalizadas, são projetados especificamente para se unir a locais no início e no final do segmento a ser copiado. Se os primers forem projetados incorretamente ou a temperatura nesse estágio estiver errada, o primer se ligará aleatoriamente ao DNA, resultando na cópia do segmento incorreto. A maioria dos primers derrete a cerca de dois terços do ponto de ebulição, e o recozimento, um processo de 1 a 2 minutos, ocorre alguns graus abaixo disso.

Os últimos passos na reação em cadeia da polimerase são chamados extensão e extensão final . É aqui que a mágica acontece. A polimerase copia o segmento de DNA rapidamente, criando milhões e milhões de cópias em poucos minutos. Geralmente, um ciclo consiste em todas as etapas anteriores, repetidas cerca de vinte ou trinta vezes.

O resultado é um monte de DNA copiado. As reações em cadeia da polimerase têm uma variedade de usos, incluindo testes de paternidade, determinando a presença ou ausência de um defeito genético ou DNA viral, clonando um gene, introduzindo mutações específicas, analisando o DNA de espécies extintas ou pessoas mortas, “impressões digitais genéticas” na cena do crime e muito mais.